（3） 樣本采集與處理

在養(yǎng)殖28和56 d時各采樣1次，其中28 d時僅測定體長、體重，并每桶取3條魚解剖取肝臟稱重。取樣前停食24 h，先對各桶魚進行計數(shù)，稱重，測量體長，計算特定生長率。每桶取3尾規(guī)格基本一致的魚，先用MS⁃222麻醉，然后用70%酒精擦拭魚體表面，在超凈臺內(nèi)無菌操作，解剖、分離并取出肝臟，對肝臟稱重，分離并取出中后腸段的內(nèi)容物，然后用滅菌解剖刀刮取腸道內(nèi)側(cè)黏膜，與內(nèi)容物混合后，液氮速凍，-80℃保存。

（4）生長指標的計算

增重率（%）=[（終末體重–初始體重）/初始體重] ×100

特定生長率（%/d）= [（ln終末體重–ln初始體重）/養(yǎng)殖天數(shù)] ×100

肝體指數(shù)（%）=（肝體重/體重）×100

（5） 腸道菌群多樣性的測定

取約0.5 g腸道內(nèi)容物與黏膜混合樣品，按照使用MP⁃bio土壤DNA提取試劑盒說明提取細菌基因組，將提取的DNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用Nanodrop對DNA的濃度和OD260 nm/OD280 nm值進行測定。

首先針對16S rRNA基因的V3 ~ V4區(qū)設(shè)計引物，引物兩端帶有12 bp的barcode，用以識別不同樣品的序列。然后進行PCR擴增，程序如下：95 ℃預變性3 min，之后進入擴增循環(huán)，循環(huán)數(shù)27，循環(huán)過程為95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后是72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物；使用Illumina測序?qū)Ｓ玫腘EB NextUltraTM DNA Library Prep Kit試劑盒按照說明建立基因克隆文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和檢測合格后，基于Illumina Miseq PE300平臺進行高通量測序（上海美吉生物工程有限責任公司）。

使用Usearch (version 7.0)軟件( http://drive5.com/uparse/)，將所得序列根據(jù)97%相似度關(guān)系進行操作分類單元(OTU)聚類分析，產(chǎn)生OTU表，并與Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb⁃silva.de)比對進行分類學分析，所用平臺為Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy. html)，統(tǒng)計后得到各樣本的群落組成。然后對群落進行基于OTU水平的α多樣性分析，所用軟件為Mothur(version v.1.30.1，http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，分析指標包括Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)以及覆蓋度(coverage)。腸道菌群組成分析及熱圖使用R語言工具作圖，主成分分析(PCA)采用R語言的vegan軟件包進行分析和作圖。

（6）數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007軟件初步整理后，使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one⁃wayANOVA)，采用Tukey法進行平均值間的多重比較，P<0.05為差異顯著，描述性統(tǒng)計值以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2. 結(jié)果與分析

（1）植物乳桿菌對細鱗鮭生長的影響

由表2可知，經(jīng)過56 d的養(yǎng)殖，對照組試驗魚體重為(18.23±0.45) g/尾，試驗組試驗魚體重為(19.08±0.14) g/尾，組間差異顯著(P <0.05)；試驗組的增重率在養(yǎng)殖28及56 d時均顯著高于對照組(P<0.05)。試驗組的特定生長率在養(yǎng)殖28及56 d時均顯著高于對照組(P

（2） 基于16S rRNA 基因測序的α多樣性

獲得原始序列數(shù)1228410條，經(jīng)過質(zhì)量控制，包括去除質(zhì)量值低于20的尾部堿基及含氮的堿基，根據(jù)雙端序列間的重疊關(guān)系進行序列拼接，通過末端條形碼識別得到每個樣本的序列，最終得到優(yōu)化序列數(shù)312339條，平均序列長度為444.85bp。其中對照組獲得的有效序列數(shù)為43165條，試驗組獲得的有效序列數(shù)為58910條，2組之間差異顯著(P<0.05)(表3)。在后續(xù)分析中，為降低統(tǒng)計誤差，將每個樣本序列數(shù)抽平至37818條。

各組的覆蓋度均約等于1.00，說明了該測序結(jié)果已基本覆蓋樣本的多樣性?；?7%相似性水平劃分得到810個OTU，它們分別歸屬644個種、454個屬、213科、113目、53綱、26門。α多樣性指數(shù)包括Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)，對對照組和試驗組α多樣性指數(shù)的平均值進行顯著性分析，結(jié)果顯示2組之間上述指標均存在著顯著差異(P < 0.05)(表3)。此外，Sobs指數(shù)由對照組的439降低到試驗組的196，組間差異顯著(P<0.05)(表3)，表明植物乳桿菌的添加顯著降低了樣本中所觀察到的物種數(shù)目；Shannon指數(shù)由對照組的4.0183降低到了試驗組的1. 3275，Simpson指數(shù)由對照組的0.0986升高到了試驗組的0.4029，表明對照組細鱗鮭腸道菌群多樣性較試驗組腸道高，植物乳桿菌的添加顯著降低了細鱗鮭腸道菌群多樣性；Chao指數(shù)由對照組的446.2992降低到了試驗組的249.3476，Ace指數(shù)由對照組的443.7244降低到了試驗組的251.1307，表明對照組細鱗鮭腸道菌群物種豐富度較試驗組高，植物乳桿菌的添加顯著降低了細鱗鮭腸道菌群物種豐富度。稀釋曲線(圖1)顯示，各樣本曲線均已進入平臺期，表明測序深度可靠，能夠真實反映樣本中大多數(shù)微生物組成情況。

（3） 植物乳桿菌對細鱗鮭腸道菌群組成的影響

在門水平上，試驗組腸道菌群中，厚壁菌門的豐度達96.03%，占絕對優(yōu)勢，變形菌門的豐度為2.54%，其他門類的豐度均低于1%。對照組腸道菌群中，厚壁菌門的豐度為23.79%，相比試驗組差異顯著(P< 0.05)，藍細菌門(Cyanobacteria)的豐度為23.30%，擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度為8.95%，螺旋菌門(Spirochaetae)的豐度為6.67%，放線菌門(Actinobacteria)的豐度為5.35%，豐度低于1%的物種的總豐度很高，達到41.28%。

在屬水平上，對照組和試驗組腸道菌群組成差別也很大。對照組中豐度在1%以上的屬有11個，豐度低于1%的屬的總豐度達41.76%，其中豐度相對較高的菌屬有未命名_藍細菌門(norank_c_Cyanobacteria)(23.30%)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)(11.70%)、短螺旋體屬(Brevinema) (6.67%)、普氏菌屬(Prevotella)(3.90%)和乳桿菌屬(Lactobacillus)(2.89%)。而試驗組中豐度高于1%的菌屬僅有3個，以乳桿菌屬的豐度最高，占58.94%，微小桿菌屬(Exiguobacterium)占26.00%，腸球菌屬(Enterococcus)占10.62%，其他豐度低于1%的菌屬的總豐度僅占4.44%。

（4） 植物乳桿菌對細鱗鮭腸道菌群β多樣性的影響

三維PCA圖(圖4)顯示，來自試驗組和對照組的腸道菌群樣本分別聚類成2 個群體，這種聚類主要體現(xiàn)在主成分1(PC1)上，PC1坐標軸的影響因素占總成分的73.89%。Venn圖（圖5）分析顯示，在所有樣本的1107個OTU中，共有OTU數(shù)為359個，占OTU總數(shù)的32.40%；對照組特有OTU數(shù)達到了418個，占OTU總數(shù)的37.80%；而試驗組特的OTU數(shù)為34個，僅占OTU總數(shù)的3.10%。試驗組OTU數(shù)（393個）遠少于對照組（777個），使得物種豐富度降低約49.42%。

為反映細鱗鮭腸道菌群與植物乳桿菌處理的關(guān)系，進行了熱圖構(gòu)建分析(圖6)，圖中不同的顏色代表了不同菌群的豐度，左側(cè)代表基于屬水平的菌群系統(tǒng)發(fā)育進化樹，圖中頂端代表樣品聚類關(guān)系。熱圖顯示，對照組的3個樣本彼此臨近，而試驗組的3個樣本彼此臨近，2組樣本各自聚類成1個群體，結(jié)合菌群的進化關(guān)系，說明2組細鱗鮭腸道菌群組成差別明顯。從熱圖還可以看出，添加植物乳桿菌導致許多菌屬受到抑制甚至從腸道菌群中消失，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、桿菌屬(Geobacillus)、梭菌科-1屬(Clostridiaceae_1)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、副伯克氏菌屬(Paraburkholderia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、普氏菌屬等。此外，相比對照組，試驗組中腸球菌屬、乳桿菌屬、微小桿菌屬這3個菌屬的豐度增加明顯。與之對應(yīng)的是，Venn圖顯示多達284個OTU從試驗組中消失(圖5)，說明添加的植物乳桿菌在細鱗鮭腸道內(nèi)抑制了多種菌群的生長，改變了其菌群組成。

3. 討論

健康的腸道菌群結(jié)構(gòu)對動物多種生理機能有重要的影響，如營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、疾病預防等。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然添加植物乳桿菌未對細鱗鮭的體長產(chǎn)生顯著影響，但對細鱗鮭的體重有一定的促進作用，在養(yǎng)殖期28和56d時均提高了特定生長率。Carnevali等使用德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)投喂歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)，經(jīng)25和59 d養(yǎng)殖后，發(fā)現(xiàn)其增重率分別比對照組提高了28%和81%。Lee等用戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)飼喂日本鰻鱺(Anguilla japonica)，5周后發(fā)現(xiàn)在特定生長率、飼料轉(zhuǎn)化率及存活率方面均顯著優(yōu)于對照組。

Illumina高通量測序技術(shù)測序深度大，對菌群多樣性的反應(yīng)準確、全面，在魚類腸道菌群研究中獲得了廣泛應(yīng)用。李建柱等采用高通量測序技術(shù)分析了養(yǎng)殖池塘鰱魚、鳙魚、鯽魚、草魚的腸道菌群組成，OTU數(shù)最低298個，最高412個，Shannon指數(shù)介于2. 21 ~ 3. 09。黃麗麗等在新疆額爾齊斯河流域的3種野生冷水魚（哲羅魚、細鱗鮭及黑斑狗魚）的6個樣品中共得到了58328條有效序列，OTU 數(shù)共242個。本研究中，6個樣本共獲得了有效序列數(shù)612446條，其中試驗組（58909條）有效序列數(shù)多于對照組（43164條），對照組OTU數(shù)777個，試驗組OTU數(shù)393個，且物種多樣性和豐富度方面對照組遠大于試驗組，說明益生菌植物乳桿菌降低了養(yǎng)殖細鱗鮭腸道菌群多樣性，使其菌群種類向簡單化發(fā)展。

魚類腸道菌群組成受宿主種類、發(fā)育時期、環(huán)境和飼料影響而有所差異。對新疆額爾齊斯河流域野生細鱗鮭腸道菌群組成的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門是細鱗鮭腸道菌群中的優(yōu)勢菌門，屬水平上以嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、梭菌屬(Clostridium)等的比例較高。本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖細鱗鮭腸道微生物種類豐富，優(yōu)勢菌門也是變形菌門，此外，厚壁菌門及藍細菌門的豐度也很高；在屬水平上與野生細鱗鮭差別較大，以勞爾氏菌屬、短螺旋體屬、普氏菌屬等的豐度較高。Lyons等同樣使用高通量測序技術(shù)研究了虹鱒的腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)γ-變形菌門占優(yōu)勢，其中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的耶爾森氏菌屬(Yersinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、哈夫尼菌屬(Hafnia)和肥大桿菌屬(Obesumbacterium)等優(yōu)勢明顯?？偨Y(jié)來說，變形菌門是冷水魚腸道菌群中常見的優(yōu)勢菌門，而在屬水平上隨著種類、養(yǎng)殖環(huán)境的變化差異更大。

本研究表明，飼料中添加植物乳桿菌使細鱗鮭腸道菌群中益生菌的豐度增加，其中乳桿菌屬的豐度由對照組的2. 89%提高到了試驗組的58.94%，增加了近20倍。此外，微小桿菌屬、腸球菌屬也占有很高的比例，它們均屬厚壁菌門的產(chǎn)乳酸菌。這些菌屬所占比例的增加使得試驗組腸道菌群中厚壁菌門的豐度達到了98%以上。微小桿菌屬能夠利用糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，主要產(chǎn)乳酸、乙酸和甲酸，該屬很多種類被開發(fā)為益生菌，用于環(huán)境改良。腸球菌屬也是乳酸菌家族的重要成員，來自該屬的許多乳酸菌用于食品發(fā)酵及維持動物腸道健康等，特別是糞腸球菌，是該屬中最具代表性的益生菌，該菌不但可以產(chǎn)生乳酸，還可以分泌細菌素，抑制有害菌群的發(fā)展。而乳酸菌作為益生菌也被廣泛用于調(diào)控動物腸道菌群，增強宿主免疫力，抑制有害菌群，改善動物營養(yǎng)吸收、生長、發(fā)育與繁殖等。類似的研究結(jié)果也在鯽魚、羅非魚及虹鱒等魚類的腸道菌群研究中得到證實，表明植物乳桿菌對魚類腸道乳酸菌數(shù)量的提高具有顯著的效果。

物種豐富度是指群落中物種數(shù)目的多少，本試驗結(jié)果表明植物乳桿菌使細鱗鮭腸道菌群物種數(shù)目變少，在OTU水平上顯示49.42%的OTU由于植物乳桿菌的添加而從腸道菌群中消失，表明植物乳桿菌抑制了許多腸道菌群的生長，降低了細鱗鮭腸道菌群的多樣性。而這些消失的菌群很多是腸道內(nèi)有害的革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌屬、短螺旋體屬、桿菌屬、梭菌科、芽孢桿菌屬、副伯克氏菌屬、鏈球菌屬及類諾卡氏菌屬等。植物乳桿菌對藍細菌門的抑制作用也很顯著，其豐度從對照組的23.3%降低到了試驗組的<1%。藍細菌是一類廣泛存在于環(huán)境中的古老菌群，經(jīng)常在動物腸道內(nèi)檢測到。藍細菌并非魚類腸道固有微生物，而是來自餌料攜帶或水環(huán)境。對鯽魚的研究也發(fā)現(xiàn)，益生菌在增加乳酸菌豐度的同時，顯著降低了另外一些細菌的豐度，如好氧菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。

本試驗通過在飼料中添加植物乳桿菌研究益生菌對細鱗鮭腸道菌群多樣性的影響，揭示了養(yǎng)殖模式下細鱗鮭腸道菌群的組成及其益生菌調(diào)控效應(yīng)，為今后在魚類腸道微生物菌群調(diào)控技術(shù)方面以及在腸道微生物層面上研究冷水魚營養(yǎng)與生長、免疫與疾病等提供參考。

4． 結(jié)論

① 飼料中添加植物乳桿菌可以顯著提高細鱗鮭的特定生長率。

② 養(yǎng)殖細鱗鮭腸道菌群在門水平上以變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門為主；在屬水平上分布較均勻，勞爾氏菌屬、短螺旋體屬、普氏菌屬的豐度較高但未形成優(yōu)勢菌屬，菌屬種類繁多且豐度都較低。

③ 飼料中添加植物乳桿菌顯著改變了細鱗鮭腸道菌群組成，在門水平上厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，在屬水平上乳桿菌屬占優(yōu)勢，未命名＿藍細菌門豐度明顯下降。　　

④ 綜合認為，飼料中添加植物乳桿菌可使細鱗鮭腸道菌群物種多樣性和豐富度降低，益生菌豐度增加，并可促進細鱗魚生長。

相關(guān)鏈接：酶+菌融合預消化技術(shù)典型代表產(chǎn)品——養(yǎng)豬專用復合益生菌——規(guī)模養(yǎng)豬低成本生態(tài)健康養(yǎng)殖更好更專業(yè)復合益生微生物制劑產(chǎn)品，可以高溫制粒、直接加入飼料中、飲水中添加

【視頻】原聲不使用養(yǎng)豬專用復合益生菌與使用豬場的區(qū)別

相關(guān)鏈接——

①.99多功能飼料發(fā)酵劑——高濃度乳酸菌為主的固態(tài)飼料發(fā)酵劑，更輕易成功、效果更好的生物飼料發(fā)酵劑，簡單好用的中草藥發(fā)酵劑 

②.99多功能飼料發(fā)酵劑，酶菌結(jié)合飼料發(fā)酵劑中的佼佼者，幾項數(shù)據(jù)對比讓你信服

③.【視頻】部分發(fā)酵飼料養(yǎng)豬雞鴨帶給你無臭味健康無抗養(yǎng)殖效果

④.【視頻】發(fā)酵豆渣養(yǎng)豬新技術(shù)

⑤.御瘟湯——防控非洲豬瘟增加自制發(fā)酵中草藥體內(nèi)外運用的原生中草藥配方

⑥.動物促生長增肥原生中草藥組方——效果直觀可見，生長速度提高顯著，降低料耗提前出欄

⑦.“土味十足”原生中草藥配方——效果顯著的動物肉蛋品質(zhì)改良中草藥配方，比放養(yǎng)更土味十足

⑧.效果極佳的“多功能增強型雙黃連散”原生中草藥組方 

⑨.一種快速促進豬雞鴨快速生長增重的中草藥配方和運用方法

10.豬場復產(chǎn)成功案例，防控非洲豬瘟運用自制發(fā)酵中草藥更易成功，不需大設(shè)施投入成本低廉

11.創(chuàng)業(yè)養(yǎng)殖場先種好牧草，享受政策和降低養(yǎng)殖風險路更寬

12.2020年多年生禾本科高產(chǎn)牧草品種推薦，亞熱帶與大棚內(nèi)可四季產(chǎn)出，提供專業(yè)種植、加工、利用、形成生態(tài)循環(huán)一條龍服務(wù)

13.養(yǎng)殖場廢水（污水）最簡單的快速處理技術(shù)，達標農(nóng)灌水或者變成無臭味不燒苗的液態(tài)有機肥技術(shù)

14.新建豬場用哪種模式好？新型水泡糞技術(shù)模式節(jié)約30%以上建設(shè)成本與減少70%以上糞污處理環(huán)保建設(shè)

15.豬場復養(yǎng)如何才能成功？推薦自制發(fā)酵中草藥組合拳模式！數(shù)百成功案例歡迎驗證

16.豬場發(fā)現(xiàn)疑似感染非洲豬瘟后如何快速控制下來（20余天達到滿意效果，有大量成功案例）

17.養(yǎng)殖場托管找廣西助農(nóng)公司，無專業(yè)技術(shù)員也能夠高效益生產(chǎn)，總有一種模式適合你

18.養(yǎng)殖場環(huán)保與糞污資源化利用找廣西助農(nóng)公司，聯(lián)系我們