葡萄糖氧化酶及其在養(yǎng)豬上的應用研究進展情況
導讀
我國飼用酶制劑經(jīng)過30多年的發(fā)展，主要應用在以下兩大領域：一是補充動物體內(nèi)消化道酶的不足，直接提高日糧營養(yǎng)的消化利用（脂肪酶等外源性消化酶）；二是消除飼料中的抗營養(yǎng)因子，間接改善日糧營養(yǎng)的消化利用（木聚糖酶等非淀粉多糖酶）。許多試驗和實際應用結果都表明，飼用酶制劑作為一種飼料添加劑能有效地提高飼料的利用率、促進動物生長和防止動物疾病的發(fā)生，與抗生素和激素類物質相比具有卓越的安全性，引起了全球范圍內(nèi)飼料行業(yè)的高度重視。然而過去酶制劑飼料應用取得的成功也是基于這些方面的研究和認識，飼料酶制劑發(fā)展到現(xiàn)在，正面臨新的突破和拓展。在食品安全和飼料安全的大趨勢下，禁止使用抗生素的所謂“無抗”養(yǎng)殖有一個艱難的過程。2015年，中國打響了“飼料禁抗”的第一槍，農(nóng)業(yè)部首次正式發(fā)布“禁抗令”。“飼料禁抗”是畜牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢，是保障食品安全、推動健康養(yǎng)殖的必由之路。而以葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）為代表的“第三代分解型酶制劑”，是一種潛力很大的酶制劑，其通過非藥物性機制和途徑殺菌抑菌改善動物消化道的微生態(tài)及理化環(huán)境的作用，從而提高動物的生產(chǎn)性能。為飼料酶制劑在替代藥物抗生素的健康養(yǎng)殖中開辟了一個新領域。
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一種通過分子氧作用將β-D-葡萄糖催化生成葡萄糖酸和H2O2的一種黃素糖蛋白。GOD早在1928年由Muller發(fā)現(xiàn)，一年之后Fleming從點青霉中分離提純得到GOD。GOD能從很多不同的真菌中提純而來，目前主要從黑曲霉和青霉中分離，其中從青霉中分離的GOD表現(xiàn)出更好的動力學優(yōu)勢。GOD來源廣泛，分布于動物、植物及微生物體內(nèi)，是一種安全無毒副作用的新型酶制劑。然而目前，系統(tǒng)闡述GOD對豬生產(chǎn)性能影響的報道還很少。因此，為了方便人們系統(tǒng)的了解GOD在豬飼養(yǎng)中的研究進展，本文從GOD的酶屬性、對豬生長性能、免疫功能及腸道微生物四個方面介紹了GOD對豬生產(chǎn)性能的影響及其機制，并指出了當前GOD在養(yǎng)豬業(yè)上存在的問題及應用有待研究的問題，同時對飼用GOD的應用發(fā)展提出了幾點建議和展望，以便我們對GOD有更深入了解，開發(fā)出好的復合型飼料添加劑。
1葡萄糖氧化酶屬性
高純度的GOD為淡黃色晶體，易溶于水，不溶于乙醚，氯仿、甘油等，分子量為15萬單位左右：Frederick等將編碼GOD的基因植入酵母中，隨后分泌出酶，發(fā)現(xiàn)GOD含有兩單位黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），而結合在葡萄糖較深處FAD能夠在細胞呼吸代謝中催化物質氧化還原反應，葡萄糖結合的活性位點在FAD的上面，處于較深的立體結構中。GOD在pH值為4.8~8.0之間具有很好的穩(wěn)定性，最適pH值為6.0，而pH值大于8或小于2時，會導致酶的迅速失活。豬胃、小腸中的pH值分別為2.0~5.4、6.5~7.2，因此GOD能夠在小腸中更好的發(fā)揮作用。GOD作用溫度為20~60℃，最適溫度35℃。GOD耐溫性能及存儲穩(wěn)定性良好，經(jīng)85℃處理1 min，酶活保持在80％以上，避光、干燥處保存12個月活力不低于90％。
GOD能從很多不同的生物中提純而來，包括真菌、紅藻、柑橘、昆蟲、細菌類等，目前生產(chǎn)中主要從黑曲霉和青霉中分離，兩種菌株生產(chǎn)的GOD具有類似的碳水化合物，其中主要包括葡萄糖、甘露糖和氨基己糖，其中，黑霉產(chǎn)GOD含有更多的甘露糖和氨基己糖。兩種霉產(chǎn)的GOD最適pH值范圍也不相同，黑曲霉和青霉產(chǎn)的GOD的最適pH值范圍分別是3.5~6.5,4.0~5.5。米氏常數(shù)（Km）表示酶和底物之間的親和能力，Kｍ值越大，親和能力越弱，反之亦然。在同等底物濃度的條件下，Kｍ值越大，其所需的酶濃度越大，即所需添加量也越大。因而，青霉源的葡萄糖氧化酶擁有更高的底物結合能力，反應速率更快（見表1）。
GOD的催化反應，在沒有過氧化氫酶情況下，生成葡萄糖酸和過氧化氫；在有過氧化氫酶存在條件下，生成葡萄糖酸；在乙醇和過氧化氫酶存在情況下，生成葡萄糖酸、乙醛和水。
2葡萄糖氧化酶對豬生產(chǎn)影響及其機制
β-D-葡萄糖與O2在GOD的催化作用下，生成葡萄糖酸和少量H2O2。首先耗氧，表現(xiàn)出其抗氧化的功能：趙文研究表明：機體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基會破壞腸道上皮細胞的完整性造成腸道損傷。另外，GOD的輔基是FAD，因而GOD能夠消除氧自由基，保護腸道健康，從而抑制病原菌的入侵。其次，產(chǎn)生的葡萄糖酸是一種有機弱酸，能夠降低腸道pH值。而酸性環(huán)境有助于保持腸道菌群生態(tài)平衡，提高消化酶酶活及飼料消化率等作用。葡萄糖酸主要被乳酸菌發(fā)酵并且刺激丁酸鹽的產(chǎn)生，當其到達腸道后段時，能被棲息的菌群所利用，生成丁酸等短鏈脂肪酸，進而為腸道供能，而在小腸中很少被吸收，因而具有類似益生元的性質。最后產(chǎn)生的少量H2O2經(jīng)大量累積后能夠起到類似廣譜抗菌的作用，能夠有效緩解霉菌毒素中毒，保護腸道健康，因而GOD也是目前替代抗生素的重要產(chǎn)品之一（見圖1）。
2.1 對豬生長性能的影響
動物腸道微生態(tài)也是一種動態(tài)平衡的穩(wěn)態(tài)值中，首先GOD催化過程中耗氧，因為腸道中大部分病原菌都是耗氧菌，而有益微生物基本都是厭氧菌或兼性厭氧菌，而GOD催化過程中產(chǎn)生的過氧化氫能夠起到廣譜抗菌的作用。因而GOD催化反應有助于增殖有益菌，從而抑制大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌等有害菌的增殖，過氧化氫抑菌過程是一個動態(tài)的過程，它殺滅細菌的同時，促進有益菌增殖，從而達到維持腸道菌群平衡，保證動物健康。另外，胃蛋白酶原是在胃蛋白酶或者鹽酸的刺激下激活，因此pH值降低有助于激活胃蛋白酶原，產(chǎn)生胃蛋白酶。因此，GOD能夠提髙飼料消化率，改善動物腸道健康和消化能力，提高飼糧營養(yǎng)物質消化和吸收效率，促進動物生長。殷驥等在日糧中添加0.05%含45Ｕ/ｇ的GOD，結果表明，與對照組相比，試驗組日增重提高7.03％（Ｐ＜0.05），料重比降低2.75％（Ｐ＜0.05），頭均毛利潤增加16.35元，增幅10.08％。湯海鷗等也發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加100ｇ/ｔGOD，試驗組平均日增重為0.48ｋｇ，比對照組提高了35ｇ；平均日采食量為0.884ｋｇ，比對照組提高了39ｇ；料重比比對照組降低了0.067；從而改善仔豬生長性能。陳清華等在仔豬飼糧中分別添加200ｇ/ｔ GOD、0.1％金霉素作為試驗Ｉ、ＩＩ組，發(fā)現(xiàn)添加GOD組日增重、平均采食量、料肉比及腹瀉率均顯著優(yōu)于對照組，且效果比金霉素組明顯，說明GOD對動物生長性能、腸道健康均有所改善，且可替代金霉素。宋海彬等報道，在仔豬飼糧中添加0.5％ GOD，其在增加采食量、促進生長、提高飼料轉化率、減少腹瀉率等方面都有明顯效果。在斷奶仔豬飼料中添加GOD，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，添加量為100ｍｇ/ｋｇ組平均末重和平均日增重分別升高了5.07％、8.49％；添加量為200ｍｇ/ｋｇ組分別升高了10.18％、16.03％，且經(jīng)濟效益以200ｍｇ/ｋｇ添加組毛利潤最高，提高了24.13％。安文亭等研究結果表明，GOD可提髙試驗組仔豬飼料能量、蛋白質、脂肪和纖維消化率，生產(chǎn)性能和健康水平改善，試驗組的平均日增重比對照組提高12.15％~24.83％，料重比下降7.09％~10.64％，腹瀉率降低24.58％~48.76％，死淘率降低12.35％~55.76％。方金津等研究表明，GOD可通過催化作用，改善杜洛克ｘ山仔豬腸道形態(tài)結構，降低胃和十二指腸pH值，并產(chǎn)生大量的乙酸、丙酸、n-丁酸等短鏈脂肪酸（SCFAs），而SCFAs能進入盲腸和結腸對胃腸道的生長、發(fā)育具有調(diào)控作用，可為結腸上皮提供60％~70％的能量，從而提高機體對營養(yǎng)物質的消化吸收，使仔豬的生長性能得到充分發(fā)揮。
2.2 對仔豬免疫功能的影響
動物自身需要有效的防御系統(tǒng)才能避免各種病原微生物造成的侵襲。為抵御各種疾病，需要機體防御系統(tǒng)中各組成部分協(xié)同作用。完整的防御系統(tǒng)包括非特異性防御系統(tǒng)和抗原特異性免疫系統(tǒng)。腸道菌群被譽為人類的“第二基因組”，其與機體淋巴細胞組成了動態(tài)微生態(tài)系統(tǒng)，起到了保護動物健康，維持腸道正常生理功能。正常腸道菌群可促進免疫系統(tǒng)發(fā)育，維持正常免疫功能。協(xié)同拮抗病原菌入侵，發(fā)揮著重要作用。GOD通過能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的數(shù)量、菌群比例及腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，從而增強了機體對病原菌感染的非特異性免疫防御機能，主要通過兩個方面實現(xiàn)。其一是通過產(chǎn)生的H2O2以及酸性環(huán)境來抑制有害菌，從而促進有益微生物群增殖來實現(xiàn)；其二則通過阻止病原菌在胃腸道內(nèi)繁殖和定植來實現(xiàn)。腸道厭氧菌有利于腸道上皮細胞外層的黏蛋白的分泌，促進黏膜生成，其將腸道表面封閉形成屏障，阻止細菌與上皮細胞結合進人腸道細胞，并通過腸蠕動將附著在黏膜上的細菌一同排出體外，從而抑制外來細菌生長，促進營養(yǎng)物質的消化吸收，達到改善生長性能、防病治病、提髙機體免疫力的作用。葡萄糖酸經(jīng)乳酸菌發(fā)酵刺激后產(chǎn)生揮發(fā)性SCFAs，SCFAs可結合多種GPR分子，誘導Treg細胞和耐受型的DC細胞產(chǎn)生，維持腸道穩(wěn)態(tài)，最終降低Th2、過敏等炎癥反應。另外葡萄糖酸能夠降低pH值，酸性環(huán)境有助于激活免疫活性細胞及酸性蛋白酶活性、增強機體抵抗力等能力。GOD具有抗氧化作用，可以清除自由基，保護腸道上皮細胞的完整性，降低大腸桿菌沙門氏菌等感染畜禽的機會，達到防御病原菌侵襲的目的。趙國先等在蛋雞飼料中添加0.4％ GOD可顯著提髙血清總蛋白含量，0.2％~0.4％組可顯著或極顯著提高白蛋白的含量。0.4％添加組顯著降低了肌酸激酶的活性。同樣，在蛋雞飼料中添加GOD，明顯提高總蛋白和白蛋白含量，以0.4％組提髙最明顯（Ｐ＜0.05），分別提高29.46％、17.53％；GOD添加組能提髙球蛋白、鈣磷和堿性磷酸酶的含量，降低總膽固醇和甘油三酯水平以及提髙谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性，0.4％添加組顯著降低了肌酸激酶的活性。動物機體70％的娀細胞分布挪道內(nèi)，腸道免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的免疫球蛋白，占動物機體所生產(chǎn)免疫球蛋白的60％。免疫球蛋白是一種抗體蛋白，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，當機體循環(huán)抗體含量增加時，血清中球蛋白水平升高，從而提高動物機體抵抗不良環(huán)境和疾病的能力。GOD提髙總蛋白、白蛋白和球蛋白可能是因為抑制有害菌（ 大腸桿菌等） 的增殖， 改善腸道緩解，提高肝臟功能， 從而提髙飼料中營養(yǎng)物質的吸收， 為體內(nèi)蛋白質的合成提供了足夠的原料。安文亭等在仔豬日糧中分別添加10、20 、30Ｕ/ｋｇGOD為試驗1 、2 、3組， 與對照組相比，試驗1 、2 、3組谷胱甘肽過氧化物酶活性分別提高25.53％ 、41.71％ 、48.11％（Ｐ＜0.05） ； 過氧化氫酶活性分別提髙9.61％ 、39.02％ 、18.08％（Ｐ＜0.05） ；超氧化物歧化酶活性分別提高5.58％ 、20.26％ 、31.59％；丙二醛含量分別降低7.14％ 、35.71％ 、31.43％ 。肝臟的生長發(fā)育會直接影響機體的免疫力， 肝臟功能的正常發(fā)揮依賴于肝臟細胞的結構完整性， 其細胞結構完整性也與抗氧化能力密切相關。肝臟谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性是顯示肝臟抗氧化、清除自由基能力的重要生理指標。丙二醛的含量反映脂質過氧化損傷程度， 其是脂質過氧化的一種重要終產(chǎn)物。GOD通過提高仔豬血清、肝臟抗氧化酶活性和抗氧化物質含量來增強機體和肝臟抗氧化力， 其機制是因為GOD分子中含有FAD，其在氧化還原反應中能夠清除自由基， 另外GOD與H2O2酶組成氧化還原系統(tǒng)同樣也能夠清除自由基， 使豬在生產(chǎn)中表現(xiàn)更強抵抗力。
霉菌毒素不僅對人體健康造成很大危害， 也會污染飼料原料， 可使畜禽嘔吐、拒食， 采食量、增重、飼料報酬、產(chǎn)蛋率、受精率下降， 還使畜禽免疫受到抑制，造成母豬繁殖障礙， 臟器損傷等， 導致免疫失敗， 疾病發(fā)生， 效益降低。機體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基會破壞腸道上皮細胞的完整性造成腸道損傷， 而在GOD催化反應過程中， 可以清除氧自由基， 保護腸道健康， 從而抑制病原菌入侵。GOD也能解除藥物中毒， 其作用原理是：一方面GOD作用生成一定量的過氧化氫， 使如黃曲霉毒素這種具備氧雜萘鄰酮基團的霉菌毒素被氧化脫氫， 分子結構發(fā)生改變， 解除毒性。另一方面通過氧化作用破壞呋喃環(huán)結構， 使環(huán)打開， 毒性消失， 從而達到脫毒的作用。此外，GOD通過消化道部分進入肝臟， 催化肝臟內(nèi)的氧化還原反應的發(fā)生， 加速了毒性成分的分解。胡常英等用含2000μg/kg濃度黃曲霉毒素B1， 和添加5％25Ｕ/ｇ GOD的飼料喂小雞， 相比對照組， 實驗組存活數(shù)量提高39.5％ ， 在小雞飲用水中加入5％ 25Ｕ/ ｍL GOD， 存活數(shù)量可提高28.5。湯海鷗等研究也發(fā)現(xiàn)， 添加GOD改善了AFB1攻毒肉鴨的生長性能， 顯著改善屠宰性能及血液生化指標， 提高T3、TSH和GH含量。臨床試驗表明，GOD可緩解飼料中霉菌毒素的危害， 降低其毒性，一定程度上提高動物的免疫力。
2.3 對豬腸道微生物的影響
腸道是動物機體最重要的消化器官之一， 是人體的第二大腦， 也是體內(nèi)最大的免疫器官， 各種營養(yǎng)物質主要在此吸收轉運， 經(jīng)由腸道感染病原微生物是引起動物死淘的重要原因。腸道微生態(tài)平衡是確保動物健康的首要保障， 另外一道保障是腸黏膜的完整性與蠕動。腸道微生態(tài)的平衡，尤其是厭氧、耐酸的有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌等）的增殖，進而使相關代謝產(chǎn)物（如乳酸、VFA等）增加，也使pH值趨于下降。腸道的pH值小于6將有利于有益菌的增殖， 抑制有害菌（大腸桿菌、沙門氏菌葡萄球菌等）的增殖。GOD在腸道中耗氧催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2， 從而產(chǎn)生厭氧酸性的環(huán)境， 促進有益菌乳酸桿菌生長的同時， 抑制好氧、不耐酸的病原微生物的繁殖。乳酸桿菌等有益菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的平衡，促進腸道的生長和發(fā)育。大腸桿菌是動物腸道的正常菌群，是調(diào)節(jié)動物體生態(tài)平衡不可缺少的細菌， 然而某些大腸桿菌的菌株是致病的原因菌， 其致病與否要看在數(shù)量上是否可以占優(yōu)勢。大腸桿菌在pH值為8時最易生長，而降低pH值對其生長有抑制作用。Franco等研究報道， 添加磷酸型酸化劑和乳酸型酸化劑對體外培養(yǎng)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有明顯抑制作用， 不同比例的富馬酸和乳酸使腸道大腸桿菌數(shù)明顯減少。Canibe等研究報道， 酸性條件可以抑制仔豬大腸桿菌等有害菌的生長繁殖，有利于乳酸菌的生長繁殖。肖晶在日糧中添加200ｇ/ｔ GOD可顯著降低仔豬胃和十二指腸的pH值和大腸桿菌的數(shù)量， 增加乳酸茵的數(shù)量， 改善十二指腸的絨毛高度。陳清華等在飼糧中添加200ｇ/ｔ 葡萄糖氧化酶可以降低仔豬胃和十二指腸的pH值和大腸桿菌的數(shù)量增加乳酸菌的數(shù)量， 改善十二指腸的絨毛高度。Biagi等試驗研究表明， 葡萄糖酸能降低斷奶仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量， 增加乳酸菌數(shù)量。楊久仙等日糧中添加0.2％ 和0.3％ GOD可以顯著降低仔豬胃和回腸大腸桿菌數(shù)量（Ｐ＜0.05）， 增加仔豬胃和回腸乳酸菌數(shù)量（Ｐ＜0.05）。
消化酶是我們細胞的驅動力， 是催化體內(nèi)數(shù)以千計生化反應的蛋白質。大部分酶在細胞內(nèi)產(chǎn)生作用，而消化酶則在腸胃道細胞外起作用。蛋白酶（ 協(xié)助消化蛋白質） 、淀粉酶（ 協(xié)助消化碳水化合物） 及脂肪酶（ 協(xié)助消化脂肪） 是三種主要消化酶， 這些酶是動物分解飼料養(yǎng)分的生物催化劑。因此， 動物消化酶分泌量不足和酶活性偏低在很大程度上限制了營養(yǎng)物質消化率的提高， 進而影響動物生產(chǎn)性能潛力的發(fā)揮。而影響消化酶的分泌量及活性的因素之一就是腸道pH值，GOD催化反應降低腸道pH值， 提高酶原的激活率， 進而提高消化酶活性。宋海彬等研究發(fā)現(xiàn)， 肉雞日糧中添加0.4％ 、0.5％ GOD均能顯著提高肉雞消化道淀粉酶和胰蛋白酶（Ｐ＜0.05）。
小腸黏膜的上皮絨毛高度和隱窩深度與腸黏膜的吸收能力存在很大的關聯(lián)，絨毛變短、隱窩變深說明絨毛萎縮，吸收能力下降激毛的高度與隱窩深度比值越大說明腸上皮表面積越大， 消化和吸收能力就會越強。肖晶在日糧中添加GOD，斷奶仔豬空腸、十二指腸的絨毛高度和VH/CD值顯著得到提高。此外，GOD催化葡萄糖產(chǎn)生的葡萄糖酸經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生揮發(fā)性短鏈脂肪酸，不僅能顯著提高移植腸絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度及絨毛面積，并能改善移植腸對氨基酸的吸收能力。
3小結
葡萄糖氧化酶作為一種新型的飼料添加劑應用，其應用價值逐漸被挖掘， 在畜禽中應用的效果必然是多方面的， 因而評價也應該是多方面的，但目前其評價體系卻尚未完善。同時目前葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)主要以黑曲霉或青霉發(fā)酵為主， 其生產(chǎn)的同時往往需要對菌絲進行破壁，并產(chǎn)生大量雜蛋白，使其分離提取難度上升，進而造成了成本的提髙及活性的降低，限制了其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應用。然而已經(jīng)有很多臨床試驗證明， 葡萄糖氧化酶能夠提高畜禽生長性能， 改善動物健康水平。隨著其生產(chǎn)技術方面的日趨成熟及綠色養(yǎng)殖概念的逐漸深入， 可以預見葡萄糖氧化酶將在畜牧養(yǎng)殖中發(fā)揮越來重要的作用。
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