飼糧不同添加量的凝結芽孢桿菌對仔豬生長性能及腸道健康的影響
在我國飼料工業(yè)全面“禁抗”、養(yǎng)殖業(yè)逐步“減抗”的發(fā)展態(tài)勢下，研發(fā)飼用微生態(tài)制劑、天然植物提取物等安全飼料添加劑及其應用關鍵技術，以保障畜禽合理的生產性能、減少養(yǎng)殖損失，成為當前我國畜牧科研工作者及企業(yè)從業(yè)人員的重點工作之一（Barba-Vidal，2018；Liu等，2018；葛長榮等，2019）。微生態(tài)制劑凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）2013年正式列入《飼料添加劑品種目錄》（程志斌等，2017；夏濤等，2019），因其良好的安全性（Endres等，2009；Endres等，2011）、耐熱性（趙樹平等，2014；鄒梅等，2017）、抑菌性（Midhun等，2018；Kawarizadeh等，2019）等優(yōu)勢，在仔豬飼料替抗應用領域得到了一定的認可與關注（Lan等，2017；程志斌等，2017；Pu等，2018；Wu等，2018）。
然而，本課題組分析以往的試驗文獻報道，前期發(fā)表綜述（程志斌等，2017），指出了凝結芽孢桿菌在仔豬料應用中的兩個尚待解決的問題：其一，與當前商業(yè)飼用抗生素相比，在保障合理的仔豬生產性能范圍內，確定凝結芽孢桿菌的適合添加量；其二，參考抗生素的作用機理，揭示凝結芽孢桿菌保障斷奶仔豬生長性能的可能機理。據此，本試驗設計了抗生素組、基礎飼糧組，對比研究不同添加量的凝結芽孢桿菌對仔豬生長性能的影響，并從部分腸道健康指標來探討其可能的作用機理。
1材 料 與 方 法
1.1 凝結芽孢桿菌
課題組從云南省曲靖市富源縣農村散養(yǎng)的地方品種豬“大河豬”腸道中，分離出一株產乳酸的芽孢桿菌，該菌株經過課題組系統(tǒng)的理化分析與16s RNA鑒定為凝結芽孢桿菌，命名凝結芽孢桿菌YNAU 3127，并用于本次動物試驗。
1.2 試驗動物與試驗分組
挑選（26±1）日齡斷奶、平均體重約7.5 kg的健康商品閹公豬（杜×長×大）30頭，平均分成5個處理組，每個處理組6個重復，每個重復1頭試驗仔豬，代謝籠單籠飼養(yǎng)。試驗處理組的分組：①處理組1：抗生素組（antibiotic group，AB），基礎日糧中添加組合抗生素（吉他霉素50 g/t、土霉素50 g/t、金霉素75 g/t）；②處理組2：基礎飼糧組（antibiotic free group, ABF），即只飼喂基礎日糧，且不添加任何抗生素及凝結芽孢桿菌；③處理組3：凝結芽孢桿菌組BC0.5（0.5×107 CFU/g Bacillus coagulans supplemented group，BC0.5），在基礎日糧中添加0.5×107 CFU/g（全價配合飼料）的凝結芽孢桿菌；④處理組4：凝結芽孢桿菌組BC1.0，在基礎日糧中添加1.0×107 CFU/g凝結芽孢桿菌；⑤處理組5：凝結芽孢桿菌組BC2.0，在基礎日糧中添加2.0×107 CFU/g凝結芽孢桿菌。具體試驗分組設計見表1。
1.3 試驗日糧
參照NRC（2012）豬營養(yǎng)需要標準，同時結合云南省豬飼料市場實際情況，配制玉米-豆粕-魚粉型試驗飼糧。試驗基礎日糧配方及營養(yǎng)水平見表2，顆粒飼料在云南快大多畜牧科技有限公司生產。
1.4 飼養(yǎng)管理
試驗期每天3次喂料，自由飲水，控制試驗豬舍合理溫度。試驗周期為仔豬26~35日齡，共10 d。
1.5 取樣及指標測定
試驗第10 d，所有試驗豬測定體重、采食量，用于平均日增重、平均日采食量、料肉比、腹瀉指數等生長性能指標的分析。腹瀉指數以籠為統(tǒng)計單元，計算公式如下：腹瀉指數(%)=(腹瀉豬只數×腹瀉天數)÷(豬只數×飼養(yǎng)天數)×100。
隨后，處死所有試驗豬，取盲腸食糜、空腸及空腸黏膜，進行以下指標測定。
1.5.1 盲腸食糜微生物菌群
盲腸食糜樣品取樣后，在-20 ℃冰箱中保存。乳酸桿菌與大腸桿菌數量的檢測在2個月內完成，檢測方法參考課題組前期的報道（黃遵錫等，2017）。
1.5.2 空腸黏膜二胺氧化酶和麥芽糖酶活性
空腸沖洗干凈食糜后，取20 cm空腸，用載玻片刮取空腸黏膜，并分成2份，放置于-20 ℃冰箱中保存。1個月內完成二胺氧化酶和麥芽糖酶活性的測定，二胺氧化酶的檢測方法參考Pan等（2017）的報道，麥芽糖酶的檢測方法參考程志斌等（2015）的報道。
1.5.3 空腸絨毛高度與隱窩深度
空腸絨毛高度與隱窩深度的測定參考Che等（2017）的方法進行，簡單描述如下?？漳c樣品取出后，在甲醛固定液中固定，隨后在二甲苯中漂洗，并用石蠟包埋。將包埋好的樣品切割出4個5 μm 厚的切片，用蘇木紅-尹紅染色，制成最終切片樣品。切片樣品在尼康雙筒目鏡（Warsaw公司，波蘭）下，放大20倍，測定絨毛高度和隱窩深度。腸絨毛高度是從隱窩開口至絨毛頂端的距離，隱窩深度是基底層至隱窩開口的距離。每張切片至少連續(xù)觀察測定20根絨毛的高度及其相應的隱窩深度，并計算平均值。
1.6 統(tǒng)計分析
除了仔豬腹瀉指數使用卡方統(tǒng)計外，其他數據進行單因素方差分析和Duncan's法多重比較。統(tǒng)計軟件使用SPSS17.0，P<0.05表示差異顯著。
2結 果 與 分 析
2.1 凝結芽孢桿菌對斷奶仔豬生長性能的影響（見表3）
由表3可知，與抗生素組（AB）相比，飼喂基礎飼糧組（ABF）仔豬的末重、平均日增重顯著下降（P<0.05），而料重比、腹瀉指數顯著上升（P<0.05）。與ABF組相比，飼糧添加凝結芽孢桿菌的BC1.0組和BC2.0組仔豬的末重、平均日增重顯著增加（P<0.05），腹瀉指數顯著下降（P
2.2 凝結芽孢桿菌對仔豬盲腸食糜乳酸桿菌和大腸桿菌菌群數量的影響（見圖1）
由圖1可見，與AB組相比，ABF組仔豬盲腸食糜的乳酸桿菌數量顯著降低（P<0.05），大腸桿菌數量顯著上升（P<0.05）。與ABF組相比，BC1.0組和BC2.0組仔豬盲腸食糜的乳酸桿菌數量顯著增加（P<0.05），大腸桿菌數量顯著減少（P
2.3 凝結芽孢桿菌對仔豬空腸黏膜二胺氧化酶、麥芽糖酶活性的影響（見圖2）
由圖2可見，與AB組相比，ABF組仔豬空腸黏膜的麥芽糖酶活性顯著降低（P<0.05）。與ABF組相比，BC1.0組和BC2.0組仔豬空腸黏膜的麥芽糖酶活性顯著增加（P
2.4 凝結芽孢桿菌對仔豬空腸絨毛高度、隱窩深度的影響（見圖3）
由圖3可見，與AB組相比，ABF組仔豬空腸的絨毛高度顯著下降（P<0.05）。與ABF組相比，BC0.5組、BC1.0組和BC2.0組仔豬空腸絨毛高度顯著增加（P
3討 論
據課題組前期發(fā)表的綜述文獻（程志斌等，2017）顯示，現有關于凝結芽孢桿菌改善斷奶仔豬生長性能的絕大多數試驗報道（周映華等，2012；黃海強，2014；Wu等，2018；張越等，2018），其參照的對照組是無任何飼料添加劑的基礎飼糧組（ABF），這顯然很容易得出凝結芽孢桿菌添加的正效應，包括本課題組前期報道（余冬友等，2017）和本試驗數據（見表3）均驗證了這一觀點。因此，本研究才進一步設計了抗生素組（AB組），所飼喂的抗生素（吉他霉素50 g/t、土霉素50 g/t、金霉素75 g/t）是近3年來我國飼料企業(yè)最常用的仔豬飼用抗生素方案（黃遵錫等，2017）。本研究目的在于評估凝結芽孢桿菌替抗的適合添加量及作用效果。
3.1 凝結芽孢桿菌對斷奶仔豬生長性能的影響
表3結果顯示：與ABF組相比，3個補充凝結芽孢桿菌組的仔豬生長性能均有較大改善，尤其是BC1.0組和BC2.0組仔豬生長性能更優(yōu)異，這與課題組前期報道（余冬友等，2017）及張越等（2018）的結論基本一致。而且，本試驗首次發(fā)現，補充(1.0~2.0)×107 CFU/g凝結芽孢桿菌的BC1.0組和BC2.0組仔豬各項生長性能指標，與抗生素組仔豬差異不顯著。以上結果表明：本試驗條件下，日糧補充大于1.0×107 CFU/g高添加量的凝結芽孢桿菌，能夠使斷奶仔豬獲得與飼用抗生素較為接近的生長性能；而0.5×107 CFU/g低添加量的凝結芽孢桿菌飼喂效果，略低于抗生素效果。這些結果提示，凝結芽孢桿菌改善斷奶仔豬生長性能的作用有明顯的劑量效應，其機理可能與維持腸道健康的程度有關（Jäger等，2018；Pluske等，2018）。據此，本試驗進一步分析了以下腸道健康的部分指標。
3.2 凝結芽孢桿菌對斷奶仔豬盲腸食糜菌群的影響
腸道菌群平衡是腸道健康的基礎（Gresse等，2017；Li等，2017），因此本研究首先分析了凝結芽孢桿菌對仔豬盲腸食糜乳酸桿菌和大腸桿菌菌群數量的影響（圖1）。結果顯示：與AB組相比，ABF組仔豬盲腸食糜的乳酸桿菌數量顯著降低、大腸桿菌數量顯著上升，這是抗生素抑菌改善腸道健康、提高斷奶仔豬生產性能的重要機理之一（Li等，2017）。隨著飼糧中凝結芽孢桿菌添加量的增加，仔豬盲腸食糜的乳酸桿菌數量逐步增加、大腸桿菌數量顯著減少，這一結果與張越等（2018）的結論基本一致。進一步分析，本試驗首次發(fā)現：添加2.0×107 CFU/g凝結芽孢桿菌的仔豬盲大腸桿菌數量與抗生素組差異不顯著。這一結果表明，本試驗創(chuàng)新篩選并用于動物試驗的凝結芽孢桿菌，對革蘭氏陰性大腸桿菌的抑制效果較好，具有顯著的體內抑菌特性。以往更多的試驗報道均顯示（Midhun等，2018；Kawarizadeh等，2019）：凝結芽孢桿菌在體外實驗室培養(yǎng)條件下，對有害大腸桿菌具有顯著的抑制作用；但這一體外抑菌效果并未在動物飼喂試驗（體內）中與抗生素抑菌效果進行比較驗證，而本研究首次彌補了這一空白。
3.3 凝結芽孢桿菌對斷奶仔豬空腸黏膜麥芽糖酶、二胺氧化酶活性的影響
麥芽糖酶是仔豬腸上皮細胞合成并分泌進入腸腔，用于分解食糜中二糖、三糖的關鍵酶之一（程志斌等，2015；Xiong等，2019）。由于仔豬腸上皮細胞只能以各種單糖的形式攝入飼料碳水化合物，因此麥芽糖酶對仔豬碳水化合物的營養(yǎng)有關鍵調控作用，所以麥芽糖酶經常用于反映幼齡仔豬腸道的發(fā)育（程志斌等，2015）和（或）損傷程度（蒲俊寧等，2018）。圖2結果顯示：日糧補充（1.0~2.0）×107 CFU/g凝結芽孢桿菌的仔豬空腸黏膜的麥芽糖酶活性，與抗生素組差異不顯著，且均高于飼喂基礎飼糧的仔豬。這一結果表明：凝結芽孢桿菌與抗生素均有利于維護腸道機械屏障的完整性，有助于保障斷奶仔豬的腸道健康。眾所周知，腸道大腸桿菌、尤其是致病大腸桿菌所分泌的毒素、崩解的脂多糖等多種有害物質，極易破壞腸黏膜上皮細胞，造成腸上皮滲透性增加，腸道機械屏障完整性受損（Gresse等，2017；Luise等，2019）。結合圖1的腸道菌群數據，以上結果證明：日糧補充凝結芽孢桿菌能夠通過抑制腸道有害菌及其可能的有害代謝產物，來減少對斷奶仔豬腸道上皮細胞的損傷，且這一作用有明顯的劑量效應。
此外，二胺氧化酶活性也經常用于評估腸道機械屏障的完整性，即判斷腸黏膜損傷程度（Pan等，2017；Wu等，2018），因為二胺氧化酶與上皮細胞內的核酸和蛋白合成密切相關，是上皮細胞損傷修復與更新的關鍵調控酶之一（Wu等，2018）。然而，本試驗結果顯示（見圖2）：空腸黏膜二胺氧化酶活性，所有處理組之間差異不顯著。我們推測本試驗條件下，空腸黏膜二胺氧化酶活性差異不顯著的可能原因包括：其一，在本實驗室飼養(yǎng)試驗環(huán)境衛(wèi)生控制很好的情況下，所有試驗仔豬腸黏膜的損傷程度在可接受的范圍內，且二胺氧化酶的活性數值較小，這就造成活性數據統(tǒng)計上的差異不顯著。其二，就反映腸黏膜正常生理和（或）損傷程度而言，可能二胺氧化酶不如麥芽糖酶敏感，因為麥芽糖酶的活性數值較大。
3.4 凝結芽孢桿菌對斷奶仔豬空腸絨毛形態(tài)的影響
仔豬腸黏膜上皮細胞來源于隱窩處干細胞的分裂、增殖、增生和逐步向絨毛頂端的遷移，細胞在遷移過程中逐步完成功能的成熟，這些功能包括正常的消化、吸收和分泌等功能（Ji等，2019），由此絨毛高度顯示腸上皮細胞的功能狀況，而隱窩深度則更加反映上皮細胞的增殖和損失更替狀況（Chen等，2019）。因此，測定腸絨毛高度、隱窩深度是評估幼齡仔豬腸道發(fā)育和功能成熟（程志斌等，2015；Ji等，2019）以及損傷修復（Che等，2017；Pan等，2017）的重要標志。圖3結果顯示：抗生素組仔豬絨毛高度顯著大于基礎飼糧組，也驗證了抗生素組仔豬腸道營養(yǎng)消化與吸收功能優(yōu)于基礎飼糧組（Li等，2017），這與表3抗生素組仔豬生長性能優(yōu)于基礎飼糧組的結果相符。進一步分析，補充凝結芽孢桿菌的3個處理組仔豬絨毛高度與抗生素組差異不顯著，結合圖1腸道菌群的數據，充分證明：凝結芽孢桿菌具有減少腸道有害菌對腸黏膜的損傷，維持斷奶仔豬腸道健康的重要作用（J?ger等，2018），且這一作用效果與抗生素相近；這是本研究高添加量凝結芽孢桿菌改善斷奶仔豬生長性能的重要作用機理。此外，圖3發(fā)現所有處理組之間的空腸隱窩深度差異不顯著，表明本試驗條件下所有試驗仔豬腸黏膜可能只發(fā)生輕微損傷，這也與圖2反映腸道損傷程度的二胺氧化酶活性結果相符。
4結 論
正常養(yǎng)殖環(huán)境條件下，斷奶仔豬無抗日糧補充凝結芽孢桿菌，具有顯著提高生長性能的作用效果，且這一效果有顯著的劑量效應。實際飼料配方應用中，添加(1.0~2.0)×107 CFU/g的凝結芽孢桿菌才能獲得與商業(yè)抗生素相近的飼喂效果，其作用機理與足量添加的凝結芽孢桿菌才能有效保護腸道健康有關。
本產品由多種特異性乳酸菌、產酶芽孢桿菌、布拉氏酵母、產朊假絲酵母、釀酒酵母、雙歧桿菌、丁酸梭菌與部分中草藥發(fā)酵而成的高活性發(fā)酵飼料產品。
【主要成分】
高濃度復合乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、淀粉酶、復合酶制劑、活性小肽、酸化劑、多維、復合氨基酸等。
【主要載體】
豆粕、魚粉、玉米粉、玉米胚芽、小麥次粉及核心原料，輔料部分為中草藥（主要有黃芪、大青葉、香附、白術、枳殼、檳榔、茯苓、金銀花、甘草等18味，2021年1月份再次升級后本品每袋不少于3公斤中草藥）。
【規(guī)格指標】
粗蛋白≥18%；粗脂肪≥5%；粗灰分≤6%；有效活菌數不同儲存時間在20-200億CUF/g。包裝規(guī)格為20公斤/袋。本產品復合飼料衛(wèi)生標準。
打開多功能生物發(fā)酵活菌肽香氣四溢并可以長時間保持，多功能生物發(fā)酵活菌肽包裝內物料，顏色會隨著時間長短而有所變化，樣品打開后由于接觸空氣在一周左右可能會霉變，請及時飼喂或者丟棄。產品打開包裝后要及時密封，并請在7-15天內喂完，以免接觸空氣后產生霉變影響質量。
【產品功效】
1.維護腸道粘膜健康，促進亞健康動物群體快速改善，提高畜禽對營養(yǎng)物質的吸收，對比提高日增重。
2.所選的有益菌的代謝產物可迅速彌補消化道中內源酶的不足，維護腸道微生態(tài)平衡，降低腸道負擔，利于營養(yǎng)的吸收，防止畜禽營養(yǎng)性腸道健康問題的發(fā)生。
3.預防幼小畜禽由于更換飼料、抓捕、運輸等刺激性因素造成的應激反應。
4.提高鈣、磷、鐵等元素與有機微量元素的吸收，增加畜禽排卵數量，提高畜禽的產仔（產蛋）數量。
5.提高飼料消化利用率，促進飼料中碳水化合物的分解，促進飼料中非蛋白氨轉化為高品質蛋白質，提高飼料利用率，提高增重和降低料肉比。
6.提高瘦肉率，降低背膘厚度，使臀肌、腿肌飽滿發(fā)達，形體豐滿結實，快速清除藥殘，改善酮體品質和風味，提高屠宰瘦肉率。
7.運用本品后輕度霉變飼料可以不再需要添加脫霉劑產品，本品的活性微生物代謝產生霉菌抑制復合物，有效抑制霉菌的生長，降低霉菌毒素的產生，降解部分霉菌毒素，達到解毒效果。較重霉變飼料建議不要使用或者另外添加脫霉劑。
8.改善養(yǎng)殖環(huán)境，快速降低養(yǎng)殖環(huán)境臭味和氨氣；減少動物糞便排泄量，糞便自然成形并減少糞便含水量，加快動物糞便自然發(fā)酵速度。
客戶反饋使用后蛋雞增產明顯
【用法用量】
豬各階段、牛羊、雞鴨鵝家禽與特種養(yǎng)殖上均可使用。混合飼料中飼喂，也可以單獨少量直接補充灑在料槽中飼喂。由于本品1公斤相當于約1.5~2公斤全價飼料能量，在每噸全價飼料中添加本品1包（20公斤）的情況下，可以減少全價飼料40公斤（1包）的使用量。
1.養(yǎng)豬上的運用：日常中每噸飼料使用本品1包（20公斤），初次使用與在周圍疫情嚴重、泌乳期、出欄前1個月可以增加2-4倍的使用量。仔豬、肉豬、母豬各階段都可以使用，用藥和免疫期間不需要停止無副作用。可以與部分全價飼料簡單混合后進入自動供料系統(tǒng)中運用。
2.家禽上的運用：每噸飼料使用本品1包（20公斤），初次使用與在周圍疫情嚴重、蛋禽、出欄前1個月可以增加2-3倍的使用量。
3.牛羊上的運用：每1噸精飼料中使用本品3-5包。
4.特種動物養(yǎng)殖上的運用：每1噸飼料中添加本品2包，出欄前一個月增加一倍的使用量；部分昆蟲養(yǎng)殖上運用本品也有恢復腸道健康和解決一些疑難問題。
5、直接撒喂方法：如果混料不方便等，可以將本產品單獨直接灑到畜禽養(yǎng)殖區(qū)投喂，撒喂比例按照1噸飼料運用本品1包的使用量飼養(yǎng)區(qū)域，盡量撒散開確保每只畜禽都能夠吃到。由于本產品非常香醇可口，畜禽都會搶吃干凈。每天撒喂1次即可。
6、飲水中運用本產品的方法：規(guī)模養(yǎng)殖場自動飲水系統(tǒng)的操作需要將本產品1包放入網紗袋內，浸入到1噸水中來回揉搓3分鐘以上，大部分本產品會融入水中，剩余不溶解的殘渣直接投喂或者拌料。每噸飲水中添加1公斤紅糖并且靜止半小時以上再給動物飲水效果更好；小規(guī)模養(yǎng)殖場或者不是自動飲水的養(yǎng)殖場，將本產品1包直接倒入到1噸飲水中后攪動一下給動物飲用即可（加入1公斤紅糖靜止半小時以上效果更好）。本產品益生菌數量多，且中草藥也會大部分會釋放出來，因此飲水也是能夠達到很不錯的效果。
【注意事項】
1.陰涼干燥處嚴格密封保存，開啟后要求在7-15天內喂完，用后及時封口確保密封。
2.與干料混合后最好在7天內喂完，在飲水中運用后要求在2天內用完。
3.免疫期間、大劑量運用抗生素時可能會降低本品中益生菌的效果，但無副作用，不需要停止使用。初次使用后幾天豬群采食量會稍有下降，這是因為運用后消化吸收率提高造成的，不會影響生長等；部分豬可能會出現拉稀，這是因為腸道紊亂導致也正好需要益生菌進行調理，一般幾天就會恢復正常；部分蛋禽初次使用產蛋率稍有下降也是因為腸道紊亂導致一般很快就能夠恢復。
【規(guī)格】20公斤/袋（市場售價一般為160-200元/袋），也可以為飼料廠、飼料添加劑廠、大型養(yǎng)殖公司定制不同規(guī)格和專用包裝、配方等。
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2020年已全面禁抗，我們之前經常在飼料中添加的抗生素進行促生長行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進動物生長又能夠形成無抗養(yǎng)殖呢？其實中草藥在促進畜禽養(yǎng)殖健康和生長、改善肉蛋奶品質大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個實施方案比你想象中效果更好，運用的沒有不被效果折服的，值得嘗試驗證
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