反芻動(dòng)物獨(dú)特的瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)能夠分解飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并合成自身所需的營(yíng)養(yǎng)，如菌體蛋白（BCP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）等。微生物發(fā)酵飼料是以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，通過(guò)微生物的代謝作用，降解部分多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，生成有機(jī)酸和可溶性小肽等小分子物質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、活菌數(shù)量高。大量研究表明，微生物發(fā)酵飼料可有效減少棉籽粕等原料的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，還能產(chǎn)生如活性肽、多糖、有機(jī)酸等活性物質(zhì)，這類物質(zhì)能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高抗氧化功能，改善動(dòng)物的腸道微生態(tài)平衡，同時(shí)可提高動(dòng)物采食量和飼料利用率。微生物發(fā)酵飼料的菌種與制備工藝不同，作用效果有很大差異，本課題組前期研究的一種微生物類發(fā)酵制劑，由高活性酵母菌和枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵而成，其主效成分包括甘露聚糖、葡聚糖、氨基酸、多肽和有機(jī)酸5種營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，能為瘤胃微生物生長(zhǎng)提供特殊的營(yíng)養(yǎng)底物，刺激瘤胃微生物的生長(zhǎng)，調(diào)控瘤胃功能。實(shí)際生產(chǎn)中盲目飼喂微生物發(fā)酵飼料的現(xiàn)象也較為常見(jiàn)，缺乏配套的使用技術(shù)，效果不佳還會(huì)增加養(yǎng)殖成本。目前，不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對(duì)體外瘤胃發(fā)酵的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)體外發(fā)酵試驗(yàn)評(píng)價(jià)不同添加水平微生物發(fā)酵飼料對(duì)奶牛的瘤胃發(fā)酵功能及飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響，為今后微生物發(fā)酵飼料在奶牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

以麩皮、米糠、棉籽粕、玉米皮等9種農(nóng)副產(chǎn)品為主要發(fā)酵原料，將課題組菌種庫(kù)的釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae，SC）2株，編號(hào)分別為XR4和BC；枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）1株，編號(hào)為A15，以XR4∶BC∶A15按菌液體積2∶2∶1混合，8％接種量接入250kg的固態(tài)發(fā)酵飼料中，加水使最終含水量為45％，于車間中30℃好氧堆積發(fā)酵48ｈ。根據(jù)本課題組前期成果，其主效指標(biāo)為：酵母菌數(shù)量≥5×10⁸CFU/g，β-葡聚糖含量≥5.484mg/kg，甘露聚糖含量≥3.438mg/kg，多肽含量≥1.36mg/g，有機(jī)酸含量≥1.48mg/g。

選擇5頭體態(tài)狀況較好、體重相近，帶有永久瘤胃瘺管的奶牛，單欄飼養(yǎng)，自由飲水。飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC（2001）奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

體外發(fā)酵試驗(yàn)中，將玉米秸青貯、羊草、苜蓿干草3種粗料與玉米、豆粕2種精料配成精粗比為5∶5的全混合日糧作為培養(yǎng)底物，對(duì)照組全混合日糧中添加奶牛濃縮料（粗蛋白質(zhì)34.60％、鈣2.05％、磷1.40％、食鹽1.20％、賴氨酸1.44％、蛋氨酸0.59％），4個(gè)試驗(yàn)組全混合日糧中分別添加3％、5％、7％和9％微生物發(fā)酵飼料。全混合日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

體外發(fā)酵裝置：恒溫水浴搖床。培養(yǎng)管為100mL的玻璃注射器，針頭的上端連接三通閥橡膠管，試驗(yàn)過(guò)程中三通閥關(guān)閉以確保嚴(yán)格的厭氧環(huán)境。涂抹凡士林在注射器活塞的四周，防止漏氣，還能使活塞向上移動(dòng)的阻力減小。瘤胃液采集和人工瘤胃培養(yǎng)液配制：在晨飼前采集奶牛瘤胃液，裝入保溫瓶迅速返回實(shí)驗(yàn)室，緩慢通入二氧化碳（CO₂）條件下，瘤胃液4層紗布過(guò)濾待用。人工瘤胃培養(yǎng)液參照Menke等的方法進(jìn)行配制。體外人工瘤胃接種：0.2g樣品放入培養(yǎng)管，加人工瘤胃培養(yǎng)液（瘤胃液∶培養(yǎng)液＝１∶２）30mL，推出氣泡。樣品做5個(gè)平行，無(wú)培養(yǎng)底物的瘤胃液作５個(gè)空白對(duì)照。記錄初始的刻度，放置于搖床中39℃條件下培養(yǎng)24ｈ。再稱取0.2g發(fā)酵底物放入150mL廣口培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶中加入120mL培養(yǎng)液，持續(xù)通入CO₂；蓋上帶有氣閥的橡皮塞；放入39℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)，用于測(cè)定干物質(zhì)體外消化率（IVDMD）。分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12、24ｈ時(shí)取樣，對(duì)培養(yǎng)液的產(chǎn)氣量、pH及氨態(tài)氮（NH₃⁃Ｎ）、VFA、BCP濃度進(jìn)行測(cè)定。

在Excel 2010中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，制作圖表；使用SAS 9.0軟件中的GLM過(guò)程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；用DPS 14.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中Topsis法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

由表3可知，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液產(chǎn)氣量逐漸升高。在培養(yǎng)3、6h時(shí)，5％、7％和9％組的產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在培養(yǎng)9h，7％組的產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），在培養(yǎng)12和24h時(shí)，7％和9％組的產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。7％組的產(chǎn)氣量平均值最高，顯著高于對(duì)照組和3％組（P＜0.05）。

由表4可知，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液pH逐漸降低。在培養(yǎng)0、3、6、9h時(shí)，各組的pH無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)12h時(shí)，9％組的pH顯著高于3％組（P＜0.05），但與其他各組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)24h時(shí)，7％組的pH最低且顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。3％組的pH平均值顯著低于對(duì)照組和9％組（P＜0.05）。

由表5可知，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液TVFA含量逐漸增加。在培養(yǎng)3h時(shí)，7％組的TVFA濃度顯著高于對(duì)照組和3％組（P＜0.05）；在培養(yǎng)9h時(shí)，5％、7％和9％組的TVFA濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在培養(yǎng)24h時(shí)，3％、5％、7％和9％組的TVFA濃度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且以7％組最高。7％組的TVFA濃度平均值最高，顯著高于對(duì)照組和3％組（P＜0.05）。

由表6可知，在培養(yǎng)0、3、6、12h時(shí)，各組乙酸濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)9h時(shí)，7％組的乙酸濃度顯著高于對(duì)照組和3％組（P＜0.05）；在培養(yǎng)24h時(shí)，7％組的乙酸濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。7％組的乙酸濃度平均值最高，顯著高于對(duì)照組和3％組（P＜0.05）。在培養(yǎng)0、3、6、9、12h時(shí)，各組丙酸濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)24h時(shí)，3％、5％、7％和9％組的丙酸濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。7％組的丙酸濃度平均值最高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在培養(yǎng)0ｈ時(shí)，對(duì)照組的丁酸濃度顯著高于3％、9％組（P＜0.05）；在培養(yǎng)3ｈ時(shí)，7％組的丁酸濃度顯著高于3％、5％組（P＜0.05）；在培養(yǎng)9ｈ時(shí)，7％組的丁酸濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但與其他各組差異不顯著（P＞0.05）。7％組的丁酸濃度平均值最高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在培養(yǎng)6、9、12、24h時(shí)，各組乙酸／丙酸無(wú)顯著差異（P＞0.05）。3％組的乙酸／丙酸平均值最低，顯著低于5％、7％、9％組（P＜0.05）。

由表7可知，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液NH₃⁃N濃度在培養(yǎng)0、3h時(shí)下降，之后又逐漸上升，在培養(yǎng)12h時(shí)達(dá)到最高值又大幅度下降。在培養(yǎng)0、3、6ｈ時(shí)，各組NH₃⁃N濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)9h時(shí)，3％、5％、7％組的NH₃⁃N濃度都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在培養(yǎng)12、24h時(shí)，各組NH₃⁃N濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。７％組的NH₃⁃N濃度平均值最高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

由表8可知，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液BCP濃度在培養(yǎng)0、3h時(shí)呈增加的趨勢(shì)，在培養(yǎng)6h時(shí)逐漸下降，在培養(yǎng)9、12h時(shí)逐漸升高趨勢(shì)，在培養(yǎng)24h時(shí)BCP濃度最高。在培養(yǎng)0、3、6h時(shí)，各組BCP濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)9、12、24h時(shí)，5％、7％組的BCP濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。7％組的BCP濃度平均值最高，顯著高于對(duì)照組及3％、9％組（P＜0.05）。

由表9可知，使用 DPS 軟件 Topsos 法對(duì)多試驗(yàn)和多指標(biāo)綜合分析，微生物發(fā)酵飼料適宜添加水平為7％。

按7％的微生物發(fā)酵飼料適宜添加水平，采用一級(jí)離體消化試驗(yàn)來(lái)測(cè)定飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外消化率。由表10可知，試驗(yàn)組的IVDMD、IVCPD、IVNDFD、IVADFD均高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組提高了0.80％、1.43％、3.76％和1.98％（P＞0.05）。

產(chǎn)氣量可反映瘤胃微生物對(duì)發(fā)酵底物的利用能力，通過(guò)試驗(yàn)中產(chǎn)氣量的測(cè)定，能估測(cè)出培養(yǎng)底物的消化水平、消化速率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)3、6h時(shí)，5％、7％和9％組的產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組；在培養(yǎng)12、24h時(shí)，7％和9％組的產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組。本課題組使用高活性的３株菌株和特殊工藝的發(fā)酵飼料，其中含有大量活性物質(zhì)，如β－葡聚糖、甘露聚糖、有機(jī)酸、多肽等，微生物發(fā)酵飼料的添加水平增加，進(jìn)入培養(yǎng)液中的有機(jī)酸、多肽等營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)含量也隨之增多，能有效提高瘤胃微生物的活性，從而增加了培養(yǎng)液的產(chǎn)氣量。

瘤胃在發(fā)酵的過(guò)程中可以產(chǎn)生的大量VFA，供給動(dòng)物機(jī)體70％左右的能量。多項(xiàng)研究證實(shí)，瘤胃內(nèi)進(jìn)行乙酸和丙酸發(fā)酵，乙酸參與了三羧酸循環(huán)，進(jìn)行氧化供能或用于脂肪酸合成，丙酸是糖異生的前體物質(zhì)，也是反芻動(dòng)物所需葡萄糖的主要來(lái)源。本試驗(yàn)中，７％組的乙酸濃度高于對(duì)照組，各組TVFA濃度均逐漸升高，說(shuō)明微生物發(fā)酵飼料能夠加強(qiáng)瘤胃的發(fā)酵功能，促進(jìn)了底物的發(fā)酵，產(chǎn)生更多的VFA。在發(fā)酵9、24h時(shí)，5％、7％、9％組的TVFA濃度顯著高于對(duì)照組。培養(yǎng)24h時(shí)與培養(yǎng)0h相比，各組乙酸／丙酸均降低，說(shuō)明添加微生物發(fā)酵飼料能改變瘤胃的發(fā)酵類型，使其趨于丙酸發(fā)酵型，從而提高了瘤胃發(fā)酵的能量利用率。

微生物發(fā)酵飼料中的氮被瘤胃內(nèi)的微生物分解，最終轉(zhuǎn)化成為NH₃⁃N和BCP。BCP合成效率為有機(jī)物用于合成微生物的效率，所以瘤胃內(nèi)合適的NH₃⁃N濃度更有利于BCP合成效率的最大化，又可以防止氮浪費(fèi)。本試驗(yàn)中，在培養(yǎng)6、9、12h時(shí)，NH₃⁃N和BCP濃度在逐漸增加，表明此時(shí)間段微生物發(fā)酵飼料能夠使飼料利用率增加，還可以使飼糧中的氮被瘤胃內(nèi)的微生物逐漸分解，微生物發(fā)酵飼料也使瘤胃微生物利用NH₃⁃N合成BCP的能力有所提高。3％、5％、7％和9％組培養(yǎng)液中NH₃⁃N和BCP濃度平均值均高于對(duì)照組，表明添加微生物發(fā)酵飼料既能使飼糧中氮轉(zhuǎn)化為NH₃⁃N的效率提高，又能為合成BCP提供充足底物，促進(jìn)了瘤胃內(nèi)BCP的合成。

干物質(zhì)、CP、NDF、ADF等降解率的大小是飼糧中衡量質(zhì)量的重要指標(biāo)，數(shù)值越高表明飼糧在瘤胃中的降解程度越高。因此，飼糧在瘤胃內(nèi)的降解能力可以客觀的表明微生物發(fā)酵飼料的作用效果和作用方式。本試驗(yàn)中，添加７％微生物發(fā)酵飼料后，試驗(yàn)組的IVDMD、IVCPD、IVNDFD、IVADFD均高于對(duì)照組，這說(shuō)明微生物發(fā)酵飼料能夠刺激瘤胃微生物更好地發(fā)酵底物，提高了飼糧中的氮轉(zhuǎn)化為NH₃⁃N等物質(zhì)的效率，合成了大量的BCP，與植物蛋白質(zhì)相比，BCP更容易被機(jī)體消化利用。

飼糧添加7％微生物發(fā)酵飼料可提高瘤胃發(fā)酵功能，提高飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外消化率。

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