地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149，由漳州大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司研發(fā)實驗室前期分離自健康豬腸道，已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號分別為CGMCC No.8147和CGMCC No.8149。

根據(jù)公司依托的國家飼用微生物國家重點實驗室數(shù)據(jù)和發(fā)酵飼料研發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗，采用玉米面、豆粕和細麩3種飼料原料作為發(fā)酵原料，比例為20%、20%和60%，地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149接種比例1：1、料液比2.5：1、總接種量8%、發(fā)酵溫度33℃。

粗蛋白和酸溶蛋白的測定按照中華人民共和國國家標準《GB/T 6432—2018》和《GB/T 22492—2008》。飼料中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白含量、胰蛋白酶抑制因子的測定均采用酶聯(lián)免疫法，試劑盒由北京龍科方舟生物工程技術有限公司提供?；罹鷶?shù)測定采用梯度稀釋涂布平板方法?？偹岬臏y定準確稱取發(fā)酵飼料樣品約0.5g，置于250mL三角瓶中，加入100mL蒸餾水，60℃水浴30min，過濾取40mL上清液，加入2~3滴酚酞指示劑，用標準氫氧化鈉溶液滴定至終點。根據(jù)以下公式計算總酸含量：總酸（%）=[(V₂-V₁)×C×0.09008]/(M×0.4)×100

式中：V₁、V₂為空白和試樣滴定時氫氧化鈉標準溶液體積（mL）；M為樣品質量（g）；C為氫氧化鈉標準溶液濃度（0.01mol/L）。

乙酸的測定準確稱取約2.5g發(fā)酵飼料樣品，置于250mL三角瓶中，加50mL蒸餾水，滴加0.5mL酚酞指示液，用標準氫氧化鈉溶液滴定至終點，溶液由無色變?yōu)榉奂t色，30s內(nèi)不褪色。根據(jù)以下公式計算乙酸含量：乙酸（%）=[(V₂-V₁)×C×0.06005]/M×100

式中：V₁、V₂為空白和試樣滴定時氫氧化鈉標準溶液體積（mL）；M為樣品質量（g）；C為氫氧化鈉標準溶液濃度（1mol/L）。

丙酸的測定按照中華人民共和國國家標準《GB/T 17815—2018》的方法進行。pH值的測定將1g樣品溶于10 mL蒸餾水中，6000 r/min 離心5min，測定上清液的pH值。乳酸的測定使用南京建成生物科技研究中心的酶學測定試劑盒。蛋白質分布檢測利用SDS-PAGE法。

本試驗采用的抑菌活性檢測方法在平板擴散方法的基礎上做了一些改進。具體步驟為：在平板內(nèi)倒入約3mL培養(yǎng)基（瓊脂含量為1.5%）作下層，待其凝固后放上3個無菌牛津杯。在5mL培養(yǎng)基（瓊脂含量為0.8%，30~40℃）中加入100μL指示菌后倒入平板，待其冷卻10min后，將牛津杯拔出，即可形成3個小孔。用移液槍在小孔中加樣，每孔加入50μL樣品，然后將平板置于37℃培養(yǎng)12~24h，觀察小孔周圍是否出現(xiàn)抑菌圈。抑菌圈的直徑比加樣孔=大至少1=mm才可以鑒定樣品有抑菌活性。

選取35日齡左右（10.0±0.56）kg三元仔豬300頭，隨機分成2組，每組6個重復，每個重復25頭豬，以欄為單元。對照組仔豬飼喂大北農(nóng)保育樂乳豬飼料，試驗組仔豬飼喂添加10%發(fā)酵飼料的對照組飼料，試驗期30d。

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2013作初步處理，用 SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

由表1可知，發(fā)酵后飼料中活菌數(shù)量大于5×10⁶CFU/g，提示發(fā)酵菌株可以利用飼料中的營養(yǎng)物質進行增殖。飼料原料經(jīng)發(fā)酵后，pH值由5.41下降到4.36，總酸則由0.78上升到2.95，乳酸和乙酸由未檢出分別上升到19582.85和3936.13mg/kg。飼料粗蛋白含量由24.13%上升到25.35%，酸溶蛋白含量由4.79%上升到5.96%。同時，蛋白電泳結果表明，發(fā)酵后飼料中小肽種類明顯增加（見圖1）。

由表2可知，飼料原料經(jīng)發(fā)酵后，飼料中抗營養(yǎng)因子含量均顯著下降（P<0.05），其中，大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量分別下降了70.2%、76.9%和79.9%。

由圖2可知，發(fā)酵飼料對常見病原菌均有一定的抑制效果，對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均超過10mm。

由表3可知，試驗組仔豬的日采食量較對照組略有提高，但差異不顯著（P>0.05）。與對照組相比，試驗組仔豬末重顯著提高（P<0.05），日增重極顯著提高（P<0.01），料重比和腹瀉率顯著降低（P<0.05），表明發(fā)酵飼料可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，同時顯著改善生產(chǎn)性能。

本試驗通過優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽等發(fā)酵組分，建立了一套低成本、高密度的發(fā)酵小試工藝，發(fā)酵液可達目標活菌數(shù)>10¹⁰CFU/mL，研究成果已獲得國家發(fā)明專利授權ZL201410807046.4。本研究將這2株益生菌用于高效呼吸袋發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，研制了一種乳仔豬專用功能性發(fā)酵飼料。本試驗中，飼料經(jīng)地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149組成的復合菌發(fā)酵后，粗蛋白含量明顯提高，可能是因為微生物能將飼料原料中的蛋白質、非蛋白氮、培養(yǎng)基中的無機氮及抗營養(yǎng)因子等各種物質分解利用轉化，合成自身高質量的菌體蛋白，使飼料中粗蛋白含量增加；也可能是因為在發(fā)酵過程中微生物生長代謝消耗了部分有機物，營養(yǎng)成分中的粗蛋白相對含量增加。任莉等報道，豆粕經(jīng)發(fā)酵后pH值下降、氣味酸香、色澤較好，且粗蛋白和粗脂肪含量均有一定程度的上升。Chi等報道，豆粕經(jīng)解淀粉芽孢桿菌、乳酸菌、植物乳酸菌和啤酒酵母菌發(fā)酵后，粗蛋白含量分別增加了6.42％、0.95％、1.91％和5.61％。劉劍飛報道，豆粕經(jīng)釀酒酵母、植物乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌組成的混合菌發(fā)酵后，有機酸含量達到2.2%，干樣pH值由6.89下降到5.32，粗蛋白含量高達53.5%。馬文強等報道，豆粕經(jīng)釀酒酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌組成的混合菌發(fā)酵后，粗脂肪和粗蛋白含量分別提高了18.2%和13.5%。

飼料原料經(jīng)過發(fā)酵之后，經(jīng)過了一系列的理化反應，復雜的大分子蛋白質會逐漸轉變?yōu)樾》肿与暮陀坞x氨基酸，同時產(chǎn)生大量營養(yǎng)豐富的菌體蛋白及代謝產(chǎn)物。陳潔梅等利用芽孢桿菌對豆粕進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后樣品中大豆肽含量從1.8％提高到29.5％，游離氨基酸含量從5.6增加到92.7mg/g。本研究中，發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量和小肽種類均明顯增加，與上述研究結果一致。鄭麗等繪制了發(fā)酵豆粕的X-衍射圖，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可以顯著提高豆粕蛋白中的β-折疊結構，而β-折疊結構的比例與大豆蛋白溶解度呈正相關。大豆肽因其聚合度小比大豆蛋白更容易吸收，且小肽之間的轉運無競爭性抑制，轉化利用率高，有利于動物蛋白質合成。

生物發(fā)酵處理可消除或降低飼料原料中的某些抗營養(yǎng)因子，如抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑、植酸、凝集素等，改善動物對飼料的利用，提高動物的生產(chǎn)性能。研究表明，芽孢桿菌很好地去除飼料中的抗營養(yǎng)因子。解淀粉芽孢桿菌能降解豆粕中包括抗原蛋白在內(nèi)的多種抗營養(yǎng)因子，利用枯草芽孢桿菌E20發(fā)酵豆粕，能去除部分抗原蛋白。劉海燕研究表明，乳酸菌發(fā)酵豆粕能顯著降低抗原蛋白的含量。本研究中，飼料經(jīng)發(fā)酵后大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量分別下降了70.2%、76.9%和79.9%，改善了飼料的營養(yǎng)價值。

研究表明，生物發(fā)酵飼料能提高仔豬的采食量、生長性能和飼料利用率，降低腹瀉率。胡新旭等利用枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)的生物飼料飼喂9.5kg左右的仔豬，結果表明，與對照組相比，20%發(fā)酵飼料組仔豬日增重提高6.37%，料重比降低5.54%，腹瀉率顯著降低63.63%。肖軻采用乳酸菌發(fā)酵的全價料飼喂25kg左右的生長育肥豬，各組豬日采食量無顯著差異，7.5%添加組豬的末重和日增重顯著提高，料重比和腹瀉率顯著降低。本研究中，飼喂生物飼料仔豬的采食量有所上升，日增重極顯著提高，料重比與腹瀉率顯著降低，與上述研究結果一致，表明地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149復合發(fā)酵飼料可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，顯著提高生產(chǎn)性能。究其原因，飼料經(jīng)生物發(fā)酵后理化性質發(fā)生了改變，小肽含量明顯上升，顯著改善仔豬對養(yǎng)分的消化率和飼料利用率，從而提高了各項生長性能指標。另外，飼料發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸、乙酸、丙酸等有機酸，pH值明顯下降，起到了酸化劑的作用，可刺激仔豬唾液的分泌并增進動物的食欲，而且有機酸具有獨特的酸香味可提高飼料的適口性。飼料中的有機酸還能抑制腸道潛在病原菌增殖，改善腸道菌群平衡，降低腹瀉率，進一步改善了動物的生長性能。

利用地衣芽孢桿菌8147和干酪乳桿菌8149復合發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料，其營養(yǎng)價值明顯提升，抗營養(yǎng)因子含量顯著下降，可以顯著提高仔豬的生長性能。