豆粕菌酶協(xié)同發(fā)酵研究表明具有改善口感，提升營養(yǎng)功效
隨著畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，飼用大豆需求量不斷攀升。但豆粕中存在致敏蛋白和多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，會影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，在一定程度上限制了其在飼料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用。在已知的38種大豆過敏原蛋白中，由α（58~77 kDα）、α' ( 58~83 kDa)和β（42~53 kDa）3個亞基組成的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)是免疫原性最強(qiáng)的大豆蛋白，約占大豆種子全蛋白含量的30%，會引起幼齡動物如豬和牛等產(chǎn)生過敏反應(yīng)。
在豆粕飼料加工生產(chǎn)中，通過有效的加工來降低或消除大豆蛋白的抗原性至關(guān)重要。在這其中，β-伴大豆球蛋白中β亞基熱穩(wěn)定性和酶耐受性最強(qiáng)，不易在加工過程中完全去除。研究表明，現(xiàn)如今已開發(fā)了多種加工方法和技術(shù)，例如熱處理，酶水解，發(fā)酵和糖化等，但熱處理時過度加熱會降低賴氨酸和其他必需氨基酸的消化性，其他常規(guī)處理也難以有效除去抗原蛋白。微生物發(fā)酵可以去除抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏蛋白，而不破壞豆粕的營養(yǎng)成分。同時，酶水解也是改變大豆蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，降低其致敏性，改善其生化功能的有效方法。酶水解可以破壞蛋白質(zhì)肽鏈，產(chǎn)生分子量較低的肽或氨基酸，改變過敏原的線性和空間表位，從而降低蛋白質(zhì)的抗原性?？莶菅挎邨U菌是一種常見的重要發(fā)酵劑，可產(chǎn)生各類酶，如堿性蛋白酶、淀粉酶等，利用枯草芽孢桿菌制備發(fā)酵豆粕，可將豆粕中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸和肽類等物質(zhì)，顯著降低致敏蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子。
如何準(zhǔn)確、快速地檢測豆粕中抗原蛋白的含量目前仍然是個難題。這對于評價豆粕產(chǎn)品的功效和營養(yǎng)價值具有重要的意義，也是確定最佳豆粕發(fā)酵工藝的重要基礎(chǔ)。目前常見的蛋白檢測方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)、高效液相色譜法等。現(xiàn)有的β-伴大豆球蛋白的檢測技術(shù)的主要開發(fā)思路以抗原免疫反應(yīng)為主，采用自制的兔抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗體建立了間接競爭ELISA檢測方法，YOU等基于單克隆抗體6G4建立了競爭性ELISA檢測方法，檢出限為2.0 ng/mL。這些方法雖然在特異性、靈敏性方面各有優(yōu)勢，但均對分析條件有比較高的要求，抗體血清的制備比較復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)室差異無法保證重復(fù)性，很難實(shí)際應(yīng)用于豆粕樣品的快速檢測。近年來，靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)使適配體傳感器在分析方法中得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)室篩選能夠與β-伴大豆球蛋白β亞基特異性結(jié)合的核酸適配體，選用納米金(gold nanoparticles，AuNPs)作為比色探針，構(gòu)建了納米金適配體比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了β亞基的快速檢測，為發(fā)酵豆粕過程評價抗原蛋白含量奠定基礎(chǔ)。該傳感器在靈敏度和檢測效率方面具有優(yōu)異的性能，β亞基的檢測范圍為7~58 nmol/L，檢測限為2.58 nmol/L。其與ELISA檢測β-伴大豆球蛋白的回收率相似，并且省去制備血清的繁瑣步驟。
本研究旨在使用納米金適配體生物傳感器評估豆粕發(fā)酵過程中的抗原蛋白含量，以β-伴大豆球蛋白的降解率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化枯草芽孢桿菌等多種菌株、發(fā)酵方式、發(fā)酵酶等關(guān)鍵發(fā)酵條件，最終獲得豆粕發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，并結(jié)合SDS-PAGE方法對比驗(yàn)證傳感器檢測結(jié)果的正確性。研究將為豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解與高值化利用以及納米金適配體傳感器在豆粕發(fā)酵生產(chǎn)中評估致敏蛋白的應(yīng)用提供參考。
材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
枯草芽孢桿菌10071（CICC10071）、枯草芽孢桿菌20522（CICC20522）、副干酪乳桿菌DY2（CCTCC2017303）、植物乳桿菌DY6（CCTCC2017138），中國典型培養(yǎng)物保藏中心；釀酒酵母BY4741、植物乳桿菌DY1、干酪乳桿菌DY13，實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2材料和設(shè)備
乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胰蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏、吐溫-80、檸檬酸三銨、葡萄糖、氯金酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、鹽酸、冰醋酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨、硫酸銨、亞硫酸氫鈉、堿性蛋白酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，豆粕，適配體的序列（5'-3'）。
多功能檢測儀，ST16R高速冷凍離心機(jī)，LF-Min-i4小型垂直電泳槽。
1.1.3培養(yǎng)基
枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基(g/L:牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，葡萄糖10.0，NaCI 5.0，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min。
YPD培養(yǎng)基(g/L:酵母浸出粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，1×105Pa滅菌30 min。
MRS培養(yǎng)基(g/L:胰蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母浸出粉4.0，葡萄糖20.0，K2HPO4 2.0，
檸檬酸三銨2.0，乙酸鈉5.0, MgSO4·7H2O 0.58, MnSO4·4H2O 0.25，吐溫-80 1 mL, pH 6.3~6.5，1×105 Pa滅菌30 min。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1發(fā)酵菌株的選擇
將實(shí)驗(yàn)室保藏菌種按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到合適的培養(yǎng)基，在適宜培養(yǎng)溫度下活化24h，按照同樣的方式活化2~3代，繼續(xù)于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到發(fā)酵菌的菌液。
將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及5%的所列發(fā)酵菌株對數(shù)期的菌液混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，同時以不添加菌液組為空白對照，30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 h。70℃烘干、粉碎，測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.2發(fā)酵方式的優(yōu)化
選取優(yōu)化獲得最佳菌株，將其按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到培養(yǎng)基中，30℃活化24 h，按照同樣的方式活化2~3代，繼續(xù)培養(yǎng)得到發(fā)酵菌液。
將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及5%的菌液以及堿性蛋白酶（200 U/g）混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，分別做不添加菌液或蛋白酶的發(fā)酵組，30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵60 h。70℃烘干、粉碎，測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.3蛋白酶添加量的優(yōu)化
控制水、糖蜜、及菌液的添加量不變，分別添加25、50、100、200、400 U/g的蛋白酶37℃發(fā)酵60 h，70℃下烘干、粉碎，測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.4菌液接種量的優(yōu)化
控制水、糖蜜、及菌液的添加量不變，分別添加25、50、100、200、400 U/g的蛋白酶37℃發(fā)酵60 h，70℃下烘干、粉碎，測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.4菌液接種量的優(yōu)化
控制豆粕中的水、糖蜜及堿性蛋白酶的添加量不變，分別接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、5%、7%、 10%、20%、30%的菌液，30℃發(fā)酵60 h、70℃烘干、粉碎，測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.5固態(tài)發(fā)酵時間的優(yōu)化
將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及7%的菌液以及堿性蛋白酶（200 U/g）混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵12、24、36、48、60、72、84 h。70 ℃烘干、粉碎，測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.7 SDS-PAGE驗(yàn)證
將1.0 g豆粕樣品溶于15 mL裂解蛋白溶液(0.03 mol/L Tri-HC1，15 g/L SDS，0.1 mol/L亞硫酸鈉)，反應(yīng)2 h，12 000 r/min離心7 min后取上清液。采用10%聚丙烯酞胺分離凝膠進(jìn)行電泳。在電泳前，將上清液與樣品加載緩沖液(5X)在水浴下加熱10 min。轉(zhuǎn)移到每個孔中的蛋白質(zhì)分散體的量約為10 μL，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶。
1.2.8氨基酸含量檢測
稱取1.0 g豆粕于具塞試管中，加入質(zhì)量濃度為5%的三氯乙酸定容至25 mL，常溫超聲20 min后靜置2h，用雙層濾紙過濾。取1 mL澄清濾液，15 000 r/min離心30 min，上清液用0.22 μm水膜再次過濾，使用Agilent 1260氨基酸專用高效液相色譜儀檢測。
1.2.9有機(jī)酸含量檢測
取1.0 g豆粕于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，漩渦振蕩15 min，10 000 r/min離心5min，取上清液，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后，進(jìn)行液相檢測。分析柱用有機(jī)酸柱(Aninex Hpx-87H ionexchange column)柱溫50℃，流動相5 mmol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，標(biāo)樣及樣品每個跑27 min。根據(jù)出峰時間和峰面積計(jì)算樣品中各種有機(jī)酸的含量。
結(jié)果與分析
2.1發(fā)酵菌株的選擇
微生物發(fā)酵能有效消除豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子，并通過產(chǎn)生蛋白水解酶將豆粕中的大分子蛋白降解為易吸收的小分子蛋白，提高營養(yǎng)價值。常見的豆粕發(fā)酵所用菌種包括枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母等。比較不同菌株固態(tài)發(fā)酵降解豆粕β-伴大豆球蛋白β亞基的效果，如圖1-a所示，固態(tài)發(fā)酵豆粕120 h后，枯草芽孢桿菌20522發(fā)酵的豆粕的蛋白降解率可達(dá)41.08%，其次是枯草芽孢桿菌10071，為34.86%。整體來看枯草芽孢桿菌在降解致敏蛋白方面的效果優(yōu)于釀酒酵母、植物乳桿菌等。同時，圖1-b的SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩組枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的β亞基條帶相對更淺，降解程度更高，而a亞基也部分降解。通過圖1-c目的蛋白條帶灰度的歸一化分析來看，枯草芽孢桿菌且尤其是20522菌株的目的蛋白占比最低，說明其含量低、降解度更高，這與傳感器的檢測結(jié)果相似。
近年來國內(nèi)外對于不同菌種發(fā)酵豆粕的研究顯示，不同菌種降解抗原蛋白的效果與其最適生長環(huán)境和分泌的蛋白酶有關(guān)，枯草芽孢桿菌往往在固態(tài)發(fā)酵條件下占據(jù)優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌中分離的堿性蛋白酶可使β-伴大豆球蛋白抗原性有效降低?？莶菅挎邨U菌的堿性蛋白酶被歸類為絲氨酸肽酶，其水解位點(diǎn)是疏水氨基酸的碳末端，可通過破壞抗原蛋白的空間結(jié)構(gòu)和表位構(gòu)象，使其降低或失去與特異性抗體結(jié)合的能力。因此，選擇枯草芽孢桿菌20522作為最佳發(fā)酵菌。
2.2發(fā)酵方式優(yōu)化
菌發(fā)酵、酶發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵是常見的豆粕固態(tài)發(fā)酵方法。除了微生物發(fā)酵，添加外源酶也可以促進(jìn)大豆蛋白活性等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解。眾所周知，酶解不僅破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，而且對破壞其高級結(jié)構(gòu)具有顯著作用。根據(jù)報道，酶水解脫脂大豆粉蛋白會降低其致敏性，最適合用于此目的的酶是堿性蛋白酶。但單純通過酶水解生產(chǎn)的小肽具有明顯苦味，生產(chǎn)成本高，限制了其開發(fā)利用。
如圖2-a所示，菌酶協(xié)同組發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白β亞基的降解程度最高，可達(dá)51.35%，其次是酶發(fā)酵，降解率為45.61 %。而菌降解蛋白在固態(tài)發(fā)酵過程中效果一般，表明蛋白酶是影響發(fā)酵過程中蛋白降解的主要因素。從圖2-b的SDS-PAGE的驗(yàn)證結(jié)果可以看出，菌發(fā)酵的豆粕蛋白條帶比較完整，酶發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的蛋白條帶大部分已經(jīng)降解，通過圖2-c灰度分析的結(jié)果顯示，蛋白含量從小到大依次是菌酶協(xié)同發(fā)酵(0.38<酶發(fā)酵（0.43<菌發(fā)酵0.86），這與納米金適配體傳感器檢測結(jié)果的趨勢基本吻合。據(jù)研究報道，菌酶協(xié)同發(fā)酵可以利用微生物分泌的酶系與外加酶共同作用處理豆粕，同時添加的蛋白酶大大提高了發(fā)酵培養(yǎng)基的整體蛋白酶活性，促進(jìn)了發(fā)酵微生物的生長、酶的分泌和糖的代謝，提高了發(fā)酵效率和質(zhì)量，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
2.3酶添加量優(yōu)化
發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中蛋白酶的活性主要受微生物分泌蛋白酶的量、pH值、微生物分泌的酶對蛋白酶的降解以及某些酶抑制成分等因素的影響。在菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝條件下，圖3-a中隨著堿性蛋白酶酶量的增加，β-伴大豆球蛋白β亞基的降解率呈上升趨勢。其中，50~200 U/g添加量間的降解效率提升最為明顯，在此區(qū)間內(nèi)酶解底物是過量的，加酶量越多，酶解反應(yīng)產(chǎn)物就越多。此后隨著酶添加量增加，降解程度變化較小，說明酶解底物反應(yīng)趨于飽和，添加過多蛋白酶并沒有較好的降解效果，還會造成蛋白酶的浪費(fèi)。經(jīng)過60 h發(fā)酵，200 U/g酶添加量組豆粕β-伴大豆球蛋白降解率可達(dá)61.94%。SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果顯示，隨著酶量的增加，β-伴大豆球蛋白β亞基條帶逐漸變淺，當(dāng)酶量≥100 U/g時效果更為明顯。因此，選擇200 U/g作為堿性蛋白酶的最佳添加量。
2.4菌液量優(yōu)化
由圖4可以看出，隨著枯草芽孢桿菌20522接種量的增加，發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當(dāng)枯草芽孢桿菌接種的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時，降解率最高達(dá)到62.78%；當(dāng)枯草芽孢桿菌接種的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時，發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率反而呈現(xiàn)下降的趨勢。在類似的枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的研究中，也存在隨著菌液接種量的增加，發(fā)酵豆粕肽含量先增加隨后下降的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)樾‰暮肯入S發(fā)酵降解蛋白而增加，隨后被又分解成更小的片段而導(dǎo)致出現(xiàn)下降。常見的豆粕發(fā)酵工藝中添加枯草芽孢桿菌菌液量大多在5%~15%。因此，選擇7%作為枯草芽孢桿菌20522菌液量的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。此外，在β-伴大豆球蛋白降解程度較高時，從SDS-PAGE的電泳圖難以觀察出各個實(shí)驗(yàn)組之間的差別，而納米金適配體傳感器的檢測結(jié)果則能夠清晰、靈敏的反映出各實(shí)驗(yàn)組豆粕的β-伴大豆球蛋白的降解率。
2.5固態(tài)發(fā)酵時間優(yōu)化
發(fā)酵過程包括微生物的生長、代謝和物質(zhì)的降解。這一過程需要一定的時間，但過度延長發(fā)酵時間可能會導(dǎo)致有害細(xì)菌污染和發(fā)酵成本增加等問題。如圖5所示，在堿性蛋白酶加酶量200 U/g，枯草芽孢桿菌20522菌液質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、料水比2:1（g/mL）、糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、發(fā)酵溫度30℃的條件下，發(fā)酵48 h~60 h，蛋白降解率有明顯提升。隨著發(fā)酵時間的增加降解率趨于平穩(wěn)，在最佳發(fā)酵時間72 h時達(dá)到最高值75.27 %。根據(jù)菌酶協(xié)同發(fā)酵的相關(guān)研究，在發(fā)酵開始時，添加的蛋白酶和發(fā)酵菌株分泌的蛋白酶協(xié)同降解蛋白質(zhì)。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，營養(yǎng)物質(zhì)和pH逐漸降低，發(fā)酵微生物生長緩慢，蛋白酶活性逐漸喪失，因此蛋白降解效率減慢。另一方面，抗原性下降的程度取決于抗原位點(diǎn)的破壞程度。發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白的抗原性在酶解后期略有增加而不是降低，是由于蛋白酶進(jìn)一步水解肽暴露了一些線性或隱性表位，或者抗原活性低的肽繼續(xù)水解成高活性的小片段。因此，菌酶協(xié)同發(fā)酵是降低致敏性的有效方法。
2.6豆粕發(fā)酵前后指標(biāo)分析
2.6.1游離氨基酸含量
如圖6所示，經(jīng)過200 U/g堿性蛋白酶和7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的枯草芽孢桿菌協(xié)同發(fā)酵72 h，豆粕總游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.50%，提高了3.96倍。其中必需氨基酸關(guān)乎飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)劣，其含量為原來的9.25倍，整體增長幅度較非必需氨基酸更為明顯，能有效地提高飼料蛋白質(zhì)的利用率。在發(fā)酵豆粕的必需氨基酸中，賴氨酸(lys)含量最高（0.37%），其次是亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)等，色氨酸(Trp)和半肽氨酸（Cys）含量最低。大部分氨基酸含量經(jīng)過發(fā)酵后均升高，尤其是Lys和蛋氨酸（Met）的含量分別為原來的17.27倍和7.73倍。Lys和Met是豬、雞飼料中最重要的2個限制性氨基酸，對家禽等的生長發(fā)育及其他所有氨基酸的消化吸收均有關(guān)鍵影響。同時，據(jù)NISHIWAKI等報道，當(dāng)疏水性氨基酸含量高時，肽的苦味相當(dāng)強(qiáng)烈，而本研究中蛋白降解釋放疏水性氨基酸，如Val、 Leu、Phe和異亮氨酸CIle，有效消除了豆粕的苦味。另一方面，β-伴大豆球蛋白含有大量的谷氨酸（Glu），豆粕發(fā)酵后游離Glu的含量顯著提高2.55倍。這也證實(shí)了β-伴大豆球蛋白在菌酶協(xié)同發(fā)酵中確實(shí)發(fā)生了明顯的降解。YANG等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對氨基酸含量的提升相較于其他微生物中具有優(yōu)勢。以上結(jié)果表明，本研究的最優(yōu)發(fā)酵工藝對蛋白質(zhì)的降解效果顯著，氨基酸含量趨于營養(yǎng)均衡，顯著提高了豆粕的營養(yǎng)價值。
2.6.2有機(jī)酸含量
有機(jī)酸作為畜禽的飼料添加劑，可直接參與機(jī)體能量、結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制有害細(xì)菌的生長，延長發(fā)酵后豆粕的保質(zhì)期。微生物發(fā)酵是產(chǎn)生有機(jī)酸的有效途徑，HENG等研究發(fā)現(xiàn)添加的蛋白酶能有效地促進(jìn)糖代謝，分泌更多的有機(jī)酸，引起的pH值下降還可以防止腐敗和病原微生物增殖。如圖7所示，經(jīng)過菌酶協(xié)同發(fā)酵處理后的發(fā)酵豆粕中各項(xiàng)有機(jī)酸指標(biāo)均有所提高。根據(jù)毛銀等研究，發(fā)酵豆粕中的酸譜根據(jù)發(fā)酵工藝的不同有較大的差別，主要以乳酸、乙酸和檸檬酸這3種有機(jī)酸為主。枯草芽孢桿菌和堿性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕中含量最高的是檸檬酸，由原來的2.68%提高到5.54%。乳酸也是衡量豆粕質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其具有維持動物腸道菌群平衡，減少腹瀉，促進(jìn)鈣質(zhì)的吸收等功能，豆粕經(jīng)過發(fā)酵后乳酸含量達(dá)到1.62%，提高了17.72倍。乙酸含量達(dá)到1.01%，其作為抗微生物劑、酸度調(diào)節(jié)劑和酸味劑，提高了飼料的適口性。除此之外，發(fā)酵還產(chǎn)生了丙酸和蘋果酸，含有多種有機(jī)酸的豆粕可以有效的抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機(jī)體的免疫力。
結(jié) 論
本研究利用新型納米金適配體傳感器從抗原蛋白降解的角度評價豆粕發(fā)酵過程。通過測定β-伴大豆球蛋白降解率，指導(dǎo)優(yōu)化枯草芽孢桿菌20522/堿性蛋白酶菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝，最終確定了最適發(fā)酵條件為:堿性蛋白酶加酶量200 U/g、枯草芽孢桿菌20522菌液質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、料水比2:1（g/mL）、糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72 h。該菌酶協(xié)同工藝在發(fā)酵豆粕降解致敏蛋白方面效果良好，β-伴大豆球蛋白降解率可達(dá)75 .27 %，此外氨基酸含量提高3.96倍，乳酸、檸檬酸、乙酸等有機(jī)酸的含量也有所上升，發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)價值和適口性得以顯著改善。同時，本研究驗(yàn)證了納米金適配體傳感器在評價豆粕抗原蛋白降解方面具有良好的特異性、穩(wěn)定性和適用性，為其在飼料行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考及實(shí)踐指導(dǎo)。
活力99增香增甜飼料發(fā)酵劑，高濃度乳酸菌、酵母菌專業(yè)酶菌結(jié)合飼料發(fā)酵劑，多功能飼料發(fā)酵劑，青貯飼料發(fā)酵劑
本產(chǎn)品是一種以高濃度乳酸菌和酵母菌等組合酶菌結(jié)合的復(fù)合專業(yè)飼料發(fā)酵劑產(chǎn)品，可以發(fā)酵我們常見的大部分飼料原料、農(nóng)家飼料、農(nóng)產(chǎn)品與食品加工下腳料，制作活性EM菌液與制作青貯飼料，具有發(fā)酵、除霉、降解纖維、提高發(fā)酵飼料營養(yǎng)與適口性且能夠長時間保存等功能，具有操作簡單成功率高、成本低廉等特點(diǎn)。
【原料組成】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌、米曲霉等，糖化酶與復(fù)合酶制劑與載體等。
【產(chǎn)品成分分析保證值】酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等合計(jì)≥100億cfu/g，水分＜9.0%。
凈重：200 克/袋。
本產(chǎn)品是在活力99生酵劑的基礎(chǔ)上的升級產(chǎn)品，升級了増香增甜等功能效果。
鑒別本產(chǎn)品真假與效果的簡單方法：500毫升左右的礦泉水瓶子中放入約50克大米+300毫升35℃左右的溫水，加入本產(chǎn)品5克，幾個小時就會產(chǎn)生大量香醇?xì)怏w，72小時內(nèi)大米基本溶解為乳狀。做試驗(yàn)時請切記要注意礦泉水瓶炸開的安全。
產(chǎn)品使用說明書
（一）制作加強(qiáng)型活性EM菌液
在非金屬容器中將本品1包（200克）與1公斤紅糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉類的飼料代替）放入約50公斤溫水中，簡單密封48小時后就變成了加強(qiáng)型活性EM菌液（每毫升活菌在100億左右）。其使用方法如下：
1.在畜禽上的使用方法：根據(jù)不同動物與飼養(yǎng)周期按其飼料重量的0.1%-0.5%拌入飼料或飲水中后飼喂或飲用。
2.養(yǎng)殖場緊急除臭生物消毒：取加強(qiáng)型活性EM菌液兌水30倍清水，對產(chǎn)生臭味與異味的養(yǎng)殖區(qū)域、糞污水道、糞堆、污水池進(jìn)行噴灑，以噴灑表面濕潤為準(zhǔn)，接待參觀前1-3小時補(bǔ)噴一次效果更好。
3.制作青貯飼料：每噸青貯飼料中加入10公斤加強(qiáng)型活性EM菌液，簡單噴灑在料上壓實(shí)密封發(fā)酵15天以上。
4.養(yǎng)殖水產(chǎn)上的使用：每畝使用5公斤加強(qiáng)型活性EM菌液進(jìn)行噴灑，晴天進(jìn)行噴灑后注意增氧。
（二）制作各種發(fā)酵飼料
本品能夠發(fā)酵木薯渣、豆渣、米粉面條加工下腳料、剩菜剩飯、米糠、統(tǒng)糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黃秸稈、牧草、紅薯藤、輕度霉變飼料等各種廉價飼料（下腳料）、各種飼料原料與全價飼料等，每500公斤待發(fā)酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加強(qiáng)型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉類的飼料原料、1公斤食鹽（含有足夠食鹽的原料就不添加），含水量調(diào)節(jié)到約60%，壓實(shí)密封發(fā)酵2-7天左右有濃郁香味時即可使用。發(fā)酵后飼料的適口性、營養(yǎng)、消化率較未發(fā)酵前有明顯提升。發(fā)酵后的飼料根據(jù)不同動物與不同飼養(yǎng)周期按照10%-50%與該動物其它全價飼料混合后飼喂（先少量飼喂適應(yīng)后逐漸增加的原則），不可以單獨(dú)飼喂或全部飼喂發(fā)酵飼料。
（三）發(fā)酵水產(chǎn)動物飼料成高濃度乳酸菌保健品
①部分發(fā)酵飼料運(yùn)用：100公斤水產(chǎn)飼料、50公斤清水、本品1包密封發(fā)酵7天以上變成高濃度乳酸菌發(fā)酵飼料，以10%比例與水產(chǎn)動物飼料混合后飼喂，或者發(fā)酵飼料單獨(dú)飼喂；②全部發(fā)酵飼料飼喂：也叫輕度發(fā)酵飼料技術(shù)，300公斤水產(chǎn)全價飼料、本品1包、水120公斤混合發(fā)酵24小時全部飼喂，這種預(yù)消化結(jié)合大量乳酸菌飼喂能夠顯著改善水產(chǎn)動物腸道健康、水質(zhì)改善等優(yōu)點(diǎn)。
（四）發(fā)酵部分禽糞做飼料
發(fā)酵雞糞（鴿子糞、兔糞等）作豬、魚等動物飼料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉類的飼料原料、500公斤雞糞，加入適量麥麩或米糠調(diào)節(jié)含水量約為55%-60%，覆蓋薄膜進(jìn)行發(fā)酵，一周左右有濃郁香味時即可使用，可代替飼料20%左右，用于喂豬或魚類等。
（五）發(fā)酵菜粕、棉粕、花生餅、茶枯脫毒
原料1000公斤，玉米面其它含淀粉類的飼料原料100公斤，食鹽2公斤，含水量調(diào)節(jié)到55%左右，本品2包，簡單地?cái)嚢杈鶆?，密封發(fā)酵15天以上成為高濃度乳酸菌小肽豐富的生物蛋白飼料，喂前攤開透氣10分鐘再作為蛋白質(zhì)原料使用于自配飼料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的發(fā)酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。
（六）中草藥及中藥渣發(fā)酵方法
1.固態(tài)中草藥發(fā)酵技術(shù)：將50公斤中草藥粉碎，越細(xì)越好放入40公斤的35℃左右的溫水中，加入玉米粉與豆粕各5公斤、本品1-2包、食鹽100克，放入塑料容器內(nèi)壓實(shí)密封發(fā)酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照飼料比例的1%以上添加到飼料或飲水中使用。
2.液態(tài)中草藥發(fā)酵技術(shù)：1公斤中草藥+1包本品+1公斤紅糖+20公斤清水混合在非金屬容器中簡單密封發(fā)酵72小時以上后使用。每噸飼料中添加10公斤或每噸飲水中添加5公斤。
（七）直接拌料或飲水、制粒飼喂、制作水料
根據(jù)不同動物在每噸飼料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2噸飲水中使用；本產(chǎn)品采用微生物多層包被技術(shù)，在每噸3包本品混合飼料中直接制粒，90℃下5分鐘不會影響效果；動物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全價飼料、1000公斤清水混合后發(fā)酵6小時以上后飼喂（預(yù)消化的輕度發(fā)酵模式），24小時內(nèi)飼喂完。
廣西助農(nóng)畜牧科技有限公司有7個專業(yè)現(xiàn)代生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)實(shí)戰(zhàn)型團(tuán)隊(duì)，為全國養(yǎng)殖場進(jìn)行生態(tài)養(yǎng)殖場的規(guī)劃、設(shè)計(jì)、建設(shè)、整改等服務(wù)；養(yǎng)殖場環(huán)保問題解決方案（養(yǎng)殖場惡臭、氨氣，蒼蠅、污水、糞便處理）與專業(yè)配套產(chǎn)品；提供全方位保姆式養(yǎng)殖技術(shù)與動物診療服務(wù)（目前廣西區(qū)內(nèi)有一百多家中小養(yǎng)殖場的托管保姆）。
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2020年已全面禁抗，我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動物生長又能夠形成無抗養(yǎng)殖呢？其實(shí)中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個實(shí)施方案比你想象中效果更好，運(yùn)用的沒有不被效果折服的，值得嘗試驗(yàn)證
我們的技術(shù)僅需在出欄前半個月左右運(yùn)用益生菌+酶制劑+中草藥相關(guān)的無違禁安全產(chǎn)品，肉質(zhì)改善非常顯著，且可以批量化生產(chǎn)。
目前我們已經(jīng)有了成熟的技術(shù)、產(chǎn)品和運(yùn)用方案，且有大量成功案例，可以在短時間、批量化、安全無違禁地為您的養(yǎng)殖場生產(chǎn)出高品質(zhì)的家畜、家禽、水產(chǎn)產(chǎn)品。
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