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鉻是人體必需的微量營養(yǎng)元素之一， 是人體內(nèi)葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）的有效活性成分。有機(jī)鉻是一類生物效價高的鉻源， 可以更顯著地促進(jìn)動物生長，改善胴體品質(zhì)和繁殖性能等。鉻進(jìn)入動物機(jī)體后經(jīng)腸道吸收，在血液里與運(yùn)送鐵的球蛋白結(jié)合，而后被運(yùn)至肝臟及全身。由于不同形式的鉻在組織中的結(jié)合程度不同，導(dǎo)致吸收率不同，因此鉻的吸收與化學(xué)結(jié)合形式有很大關(guān)系，無機(jī)鉻不但毒性大，且以極低水平吸收，吸收率約為0.4％~3.0％；有機(jī)鉻較無機(jī)鉻易被吸收，吸收率為10％~25％，其有效性約為無機(jī)鉻的10 倍以上。所以有機(jī)鉻是一種較有應(yīng)用前景的鉻補(bǔ)充物。

在有機(jī)鉻制劑中， 高鉻酵母是通過微生物發(fā)酵方法制備的，具有生物活性高、毒性小、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，并且還能同時補(bǔ)充一定量的氨基酸， 可以認(rèn)為是一種具有較好應(yīng)用前景的有機(jī)鉻補(bǔ)充物，用于防治疾病和作為飼料添加劑有著廣闊的應(yīng)用前景。該試驗(yàn)研究了1株產(chǎn)朊假絲酵母對無機(jī)鉻的富集及其影響因素，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為鉻酵母的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

高生物量菌株產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilisA7， 由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.1.2 試劑

重鉻酸鉀（分析純）、二苯氨基脲、三氯化鉻（分析純）、乙醇、高錳酸鉀、硫酸、高氯酸、鹽酸。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

水浴鍋、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫?fù)u床、高速離心機(jī)、電熱板、UV2000 紫外分光光度計。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基配方為酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、KH₂PO₄ 2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。液體種子培養(yǎng)基：酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、KH₂PO₄ 2 g、蒸餾水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同液體種子培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

比較不同鉻添加量、接種量、培養(yǎng)溫度、裝液量、發(fā)酵初始pH 值、培養(yǎng)時間對富鉻酵母生物量及鉻含量的影響， 確定試驗(yàn)用酵母菌株富集無機(jī)鉻的最佳發(fā)酵條件。

1.2.1 培養(yǎng)基中鉻離子濃度的確定

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的三氯化鉻，使Cr³⁺濃度分別為0、40、60、80、100、120、150 μg/mL（m/V），培養(yǎng)基初始pH 值5.0，121 ℃滅菌30 min，當(dāng)溫度降至30 ℃時接種，接種量為4％（V/V），每500 mL 三角瓶裝液量為50 mL，于30 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)20 h 結(jié)束，測定酵母的生物量和酵母細(xì)胞中有機(jī)鉻的含量，考察培養(yǎng)基中鉻離子濃度對酵母富集鉻的影響。

1.2.2 接種量的確定

選取溫度30 ℃，培養(yǎng)基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度100 μg/mL （m/V）， 分別按2%、4%、6%、8%、10%（V/V）接種量接種，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間20 h，做不同接種量的單因素試驗(yàn)，測定生物量及有機(jī)鉻的含量，考察接種量對酵母富集鉻的影響。

1.2.3 最適培養(yǎng)溫度的確定

培養(yǎng)基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度100 μg/mL（m/V），在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，分別在26、28、30、32 ℃下培養(yǎng)該酵母菌20 h， 測定生物量及酵母細(xì)胞中有機(jī)鉻的含量， 考察不同培養(yǎng)溫度對酵母富集鉻的影響。

1.2.4 裝液量（通氣量）對酵母富集鉻的影響試驗(yàn)

每500 mL三角瓶裝液量分別為25、50、75、100、125 mL，培養(yǎng)基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度20 μg/mL（m/V），初始pH 值為5.0，接種量4％（V/V），培養(yǎng)20 h，測定生物量及酵母細(xì)胞中有機(jī)鉻的含量，考察不同裝液量對酵母富集鉻的影響。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 值的確定

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加三氯化鉻至Cr³⁺濃度100 μg/mL（m/V），初始pH 值分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5， 每500mL 三角瓶裝液量在50 mL，接種量4％（V/V），培養(yǎng)20 h，測定其生物量和酵母細(xì)胞內(nèi)有機(jī)鉻的含量， 考察發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始pH 值對酵母富集鉻的影響。

1.2.6 發(fā)酵時間的確定

為確定不同培養(yǎng)時間對酵母生物量及鉻含量的影響，采用產(chǎn)朊假絲酵母菌株、實(shí)驗(yàn)室7 L 機(jī)械攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行。發(fā)酵罐裝量為5 L，采用上述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度30 ℃，4％（V/V）接種量，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5.0，培養(yǎng)基中加入Cr³⁺濃度100 μg/mL（m/V）的三氯化鉻。試驗(yàn)中每4 h 取樣1 次，測定生物量和酵母中有機(jī)鉻的含量，繪制富鉻酵母生長曲線及鉻富集曲線，以確定適宜的發(fā)酵時間。

1.2.7 發(fā)酵工藝穩(wěn)定性研究

為了驗(yàn)證上述試驗(yàn)得出的最佳發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性（試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性），分別采用上述試驗(yàn)所得最佳發(fā)酵工藝進(jìn)行了5 個批次的發(fā)酵試驗(yàn)， 測定生物量和酵母中有機(jī)鉻的含量， 計算變異系數(shù)以驗(yàn)證發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。

1.3 分析檢測

1.3.1 生物量的測定

將發(fā)酵液3 500 g 離心10 min，收集酵母菌體，蒸餾水洗滌3 次，除去培養(yǎng)基中無機(jī)鉻及其他成分，收集菌體，冷凍干燥后稱重即得（g/100 mL，m/V）。

1.3.2 富鉻酵母中有機(jī)鉻的測定

二苯氨基脲法。

1.3.2.1 原理

在酸性條件下， 樣品中全部鉻離子氧化成Cr⁶⁺，而在微酸性條件下，Cr⁶⁺可與二苯氨基脲（DPC）結(jié)合生成一種紫紅色絡(luò)合物，其最大吸收波長為540 nm，溶液顏色的深淺與生成物濃度成正比，即與Cr⁶⁺濃度成正比，鉻量在0~25 μg/mL 范圍內(nèi)符合比耳定律。

1.3.2.2 有機(jī)鉻含量的測定

采用透析處理法使鉻酵母中的無機(jī)鉻和有機(jī)鉻得以分離，并對透析內(nèi)液進(jìn)行消化測定，便可測得鉻酵母中有機(jī)鉻的含量。

透析： 將新鮮的富鉻酵母置于pH 值8.6 的Tris-HCl-甘油緩沖液中，加入二氧化硅進(jìn)行研磨。在電子顯微鏡下觀察，待酵母細(xì)胞完全破碎后，裝入事先處理好的透析袋內(nèi)，扎緊上端，于蒸餾水中透析，期間不斷換水，并檢測透析外液中的鉻含量，直到透析外液中檢測不出鉻時停止透析。

消化： 取上述透析袋內(nèi)液適量于100 mL 三角瓶中，加10 mL 硝酸，三角瓶頂部放小漏斗，在電熱板上微火加熱至發(fā)煙，稍冷卻后，加入3 mL 高氯酸繼續(xù)加熱，當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并冒濃白煙時停止加熱，冷卻后，加入5 mL 6 mol/L濃鹽酸，繼續(xù)消化至冒白煙時（剩余體積2 mL 左右，切不可蒸干）結(jié)束，消化后有機(jī)鉻可被完全氧化成Cr⁶⁺。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取15 mL 具塞刻度試管6 支，分別加入鉻標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 鉻濃度1.0 μg/mL，m/V）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加入1∶9 H₂SO₄ 5 mL，加入蒸餾水15 mL，加0.1 g/L 過硫酸銨溶液2 mL，加1 mg/mL 的硝酸銀溶液3 滴，混勻后，放入60 ℃水中，加熱至沸，保持25 min。冷卻后，加入5 mL 3 mol/L 氫氧化鈉溶液（pH 值1.5~2.0），搖勻，定容至25 mL，冷卻后，加入二苯氨基脲1.5 mL，搖勻，15 min 后測A540，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測定方法：取消化處理后的樣品液適量，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定，并計算樣品中鉻的含量。

2.1 培養(yǎng)基中鉻離子濃度對酵母富集鉻的影響在4%接種量時，隨著培養(yǎng)基中Cr³⁺濃度的提高，富鉻酵母中有機(jī)鉻含量也會進(jìn)一步提高，當(dāng)達(dá)到100.0 μg/mL 時，出現(xiàn)了一個高峰值（見圖1）。但當(dāng)培養(yǎng)基中Cr³⁺的濃度過高時，由于鉻元素的毒性作用，明顯抑制了酵母的生長和代謝，同化鉻到菌體內(nèi)的代謝作用也受到了抑制。當(dāng)發(fā)酵液中Cr³⁺的濃度超過100.0 μg/mL 時，酵母細(xì)胞的生長受到明顯抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小，細(xì)胞分裂遲緩，生物量下降。該試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中加入Cr³⁺濃度在100.0 μg/mL 時為好。

2.2 接種量對酵母富集鉻的影響試驗(yàn)從圖2 可以看出，隨著接種量的增加， 富鉻酵母的生物量及有機(jī)鉻的含量先增加后下降，生物量以接種量4%最高，而酵母細(xì)胞內(nèi)鉻含量以接種量6%最高，經(jīng)比較總富鉻效果后確定其最適接種量為4%~6%。

2.3 不同培養(yǎng)溫度試驗(yàn)由圖3 可以看出， 在26~32 ℃范圍內(nèi)， 發(fā)酵溫度對富鉻酵母的生物量以及酵母細(xì)胞內(nèi)有機(jī)鉻的含量均有一定影響。富鉻酵母在30 ℃發(fā)酵時，酵母生

物量最大，細(xì)胞內(nèi)有機(jī)鉻含量也最高，說明30 ℃最有利于產(chǎn)朊假絲酵母A7 對Cr³⁺的富集。

2.4 裝液量（通氣量）試驗(yàn)由圖4 可以看出，裝液量對富鉻酵母的生長和富鉻能力有一定影響，試驗(yàn)中500 mL 三角瓶裝液量50~75 mL 范圍內(nèi)酵母細(xì)胞生物量和富鉻量均較高，隨著裝液量的增加，生物量和鉻含量都明顯下降。可見適當(dāng)減少裝液量以增加通氣量并能提高富鉻酵母的生物量和富鉻量，據(jù)此推斷，在發(fā)酵罐生產(chǎn)中可以適當(dāng)加大通氣量以促進(jìn)富鉻酵母生長和對鉻的吸收。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 值對生物量和酵母細(xì)胞內(nèi)鉻含量的影響由圖5 可以看出， 初始pH 值對富鉻酵母的生長和富鉻能力有較大影響。當(dāng)初始pH 值為5.0 時生物量及細(xì)胞內(nèi)有機(jī)鉻的含量均達(dá)到最高。因此，初始pH 值應(yīng)控制在5.0 為宜。

2.6 培養(yǎng)時間的確定由圖6 可以看出， 發(fā)酵罐生產(chǎn)富鉻酵母， 酵母細(xì)胞中有機(jī)鉻的含量在發(fā)酵初期生物量很低的情況下就達(dá)到較高的水平， 說明酵母對鉻的富集是隨著酵母的生長而同步進(jìn)行的，有機(jī)鉻的含量在發(fā)酵16 h 達(dá)到最高，為2 210 μg/g，而其生物量在20 h 達(dá)到最大。綜合來看，在20 h 鉻的富集量達(dá)到最大，故發(fā)酵時間以20 h 為宜。

2.7 最優(yōu)方案下制備的酵母測試結(jié)果最優(yōu)工藝下制備的酵母生物量和有機(jī)鉻含量試驗(yàn)結(jié)果見表1。

通過以上試驗(yàn)得出富鉻酵母的最適發(fā)酵條件： 每500 mL

搖瓶裝量50 mL，溫度30 ℃，接種量4%~6％，發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始Cr³⁺濃度為100 μg/mL，初始pH 值為5.0，發(fā)酵時間為20 h。對最優(yōu)工藝條件下制備的富鉻酵母5 個批次的生物量、有機(jī)鉻含量及其變異系數(shù)來看，培養(yǎng)過程波動不大，基本穩(wěn)定，說明該工藝切實(shí)可行。

①產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）是衛(wèi)生部規(guī)定可用于保健食品的2 種酵母類菌種之一，在酵母類真菌中較之啤酒酵母在生物量方面具有明顯優(yōu)勢， 故選擇產(chǎn)朊假絲酵母作為試驗(yàn)用菌株。

②該試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母A7 菌株對鉻有相當(dāng)?shù)纳镛D(zhuǎn)化能力， 但其對鉻的富集能力并不隨培養(yǎng)基中Cr³⁺濃度的升高而一直升高， 而是有一個最佳濃度。在100μg/mL 時，富集效果最好。低于100 μg/mL 時，隨著Cr³⁺濃度的增加，產(chǎn)朊假絲酵母A7 對鉻的富集量也逐漸提高，但當(dāng)Cr³⁺濃度超過100 μg/mL 時， 則鉻的富集效果增加不明顯，且酵母的正常生長受到抑制作用。因而在工業(yè)化生產(chǎn)富鉻酵母時建議選擇在培養(yǎng)基中添加100 μg/mL Cr³⁺，發(fā)酵培養(yǎng)20 h 為宜。

據(jù)劉靜等研究推測， 鉻的富集可能與細(xì)胞膜表面的特殊蛋白載體有關(guān)，在低鉻濃度時，載體的運(yùn)載能力大于細(xì)胞所能接觸到的鉻， 這時提高培養(yǎng)基中的鉻濃度可以提高富集效果；而當(dāng)鉻濃度較高時，鉻離子相對過剩，鉻離子之間與載體競爭性結(jié)合而產(chǎn)生抑制， 反而使蛋白載體對鉻的運(yùn)載能力下降。因此，富鉻酵母培養(yǎng)中鉻的添加量至關(guān)重要。這與該試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

③通過對產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)條件的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中Cr³⁺添加濃度、接種量、發(fā)酵液的初始pH 值、溫度、轉(zhuǎn)速、時間都對富鉻酵母的生物量和富鉻能力有很大影響。

該試驗(yàn)制備富鉻酵母的最佳工藝條件為培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)基鉻添加量100 μg/mL（m/V）、接種量體積分?jǐn)?shù)為4%~6%（V/V）、培養(yǎng)起始pH 值為5.0、培養(yǎng)時間20 h。在該優(yōu)化條件下獲得的富鉻酵母生物量可達(dá)到1.83g/100 mL， 有機(jī)鉻含量可達(dá)2210 μg/g。利用產(chǎn)朊假絲酵母制備富鉻酵母工藝條件的初步優(yōu)化結(jié)果為發(fā)酵罐放大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。