添加乳酸菌和糖蜜對秸稈生物飼料的發(fā)酵品質(zhì)及 In Vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成的影響
中國是農(nóng)業(yè)大國,玉米作為主要種植的農(nóng)作物,其副產(chǎn)物玉米秸稈資源更為豐富,年產(chǎn)量約2億t。玉米秸稈是有著巨大潛力而尚未被充分開發(fā)利用的飼料資源,玉米秸稈中含有豐富的營養(yǎng)成分,是反芻動物粗飼料的主要原料之一。但是,就我國目前的情況來說,被用作飼料的玉米秸稈卻很少。這主要是因為玉米秸稈中粗蛋白(CP)含量較低,中性洗滌纖維(NDF)含量較高,而使其適口性較差。正常情況下,一般要求反芻動物飼料CP含量不低于8%,而玉米秸稈中CP含量低于8%,且消化率低,導(dǎo)致瘤胃內(nèi)沒有足夠的氮源,最終影響到瘤胃微生物的增殖和發(fā)酵翻。因此,為了克服這些限制玉米秸稈作為飼料利用的因素,提高其利用價值,我們需要對玉米秸稈進行物理、化學(xué)和生物學(xué)處理,以改善玉米秸稈品質(zhì),解決其存在的消化能低、適口性差以及粗蛋白含量低的問題,從而研發(fā)出適合我國反芻動物養(yǎng)殖業(yè)使用的優(yōu)質(zhì)粗飼料。同時也能更好的利用這個豐富而廉價的資源,解決我國反芻動物粗飼料利用率低的難題。
然而,當飼料進入瘤胃后,瘤胃中微生物發(fā)酵飼料中非纖維性碳水化合物和植物纖維,產(chǎn)生可吸收利用的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的同時,瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌生成大量的甲烷。瘤胃內(nèi)飼料總能量的12%左右以甲烷的形式損失掉的同時,甲烷作為溫室氣體也極大地加劇全球變暖。全球每年甲烷的排放量約為525Tg,其中反芻動物甲烷的排放量約為85Tg。大量的反芻動物不僅需要提供龐大數(shù)量的飼料,而且排放甲烷量也急劇上升。因此,利用秸稈調(diào)制發(fā)酵生物飼料,在擴大飼料來源,節(jié)約飼料成本,減少資源的浪費,降低空氣污染,同時也能減少瘤胃甲烷的排放,對減緩地球變暖具有重要意義。
研究通過添加糖蜜和乳酸菌,對風(fēng)干玉米秸稈進行小規(guī)模發(fā)酵處理,常溫貯存30d后開封,感官評定發(fā)酵玉米秸稈的物理性狀,分析水分,pH以及微生物組成及數(shù)量,探討玉米秸稈發(fā)酵飼料調(diào)制的可行性技術(shù),提高豐富而廉價的玉米秸稈資源的利用率。
1材料和方法1.1 試驗材料
試驗所用風(fēng)干玉米秸稈來源于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗田;糖蜜采購自濟南市歷城區(qū)圣茂化工有限公司;乳酸菌制劑(LAB,Lactobacillus plantarum,購自日本雪印公司)。
1.2 玉米秸稈的發(fā)酵及處理
采用單因素試驗設(shè)計,試驗處理包括無添加組、乳酸菌(LAB)、糖蜜(Molasses)以及乳酸菌和糖蜜共同(LAB+M)添加組。將收獲籽粒后的風(fēng)干玉米秸稈粉碎至1-2cm,菌液按照每公斤飼料1mL添加,糖蜜的添加量為4%。添加蒸餾水調(diào)整水分為60%并混合均勻。發(fā)酵用塑料袋尺寸為16x25cm,每個處理3袋,每袋200g,使用真空密封機(AT-620,北京吉奧德,北京),真空密封包裝室溫貯存30d后開封,測定各項指標。
1.3 菌種準備
將乳酸菌制劑用滅菌水溶解,每毫升菌液中含活乳酸菌數(shù)不少于1.0x105 cfu(Colony-Forming Units),4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
1.4 培養(yǎng)基
預(yù)先配制足夠的固體培養(yǎng)基,包括培養(yǎng)乳酸菌(MRS,de man,rogosa,sharpe agar)、大腸桿菌(BLU,blue light broth agar)、酵母菌和霉菌(PDA,potatodexuose agar)、好氧菌和奶熱菌(NA,nutrient agar)、酪酸菌(CLO,clostridial agar)的培養(yǎng)基,以上培養(yǎng)基均購自青島海博生物有限公司。
1.5 pH測定方法
開封后,立即從4種發(fā)酵玉米秸稈樣品中分別取20g,放入聚乙烯袋內(nèi),再加入180mL蒸餾水,隨后,用均質(zhì)器拍打90s,再用定性濾紙進行過濾,收集濾液,同時測定濾液的pH。
1.6 發(fā)酵玉米秸稈物理性狀的感官評定
根據(jù)青貯質(zhì)量評定標準的說明,主要從質(zhì)地、氣味、色澤和有無霉變這4個方面進行感官評定。
1.7 微生物培養(yǎng)與細菌形態(tài)及計數(shù)
試驗分別對4種處理的發(fā)酵玉米秸稈樣品中所含有的乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌、霉菌、好氧菌、耐熱細菌和酪酸菌進行培養(yǎng)與計數(shù)。首先,制作足夠數(shù)量的MRS、BLU、NA、DRCA、PDA(需加入20%酒石酸)的固體培養(yǎng)基備用。按照Cao等所述的方法,將4種處理的發(fā)酵玉米秸稈樣品待測菌液的原菌液依次進行梯度稀釋,分別稀釋為10倍液、30倍液及50倍液,大腸桿菌、好氧菌和耐熱細菌、酵母菌和霉菌分別在BLU、NA、PDA培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)48 h;乳酸菌、酪酸菌分別在MRS、CLO培養(yǎng)基上30℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。最后,觀察平板上長出的菌落,依依進行區(qū)分并計數(shù)(單位質(zhì)量新鮮樣品中微生物數(shù)量cfu·g-1)。
1.8 In Vitro體外培養(yǎng)
1.8.1 人工唾液
采用McDougll's緩沖液的配制方法進行配制,1 L人工唾液的組成分別為NaHCO3(9.8g),KCl(0.57g),CaCl2(0.04g),NaH2PO4 12H2O(9.3g),NaCl(0.47g),MgSO4 ·7H2O(0.12g),Cysteine hydrochloride(0.25g),Resazurin(0.001g)。
1.8.2 瘤胃液的收集
3頭安裝永久性瘤胃瘺管的綿羊提供瘤胃液。上午采食2 h后,通過3頭綿羊的瘤胃瘺管進行采集瘤胃液,采集的瘤胃液用4層紗布過濾后,等體積混合,并通入CO2保持厭氧環(huán)境。
1.8.3 培養(yǎng)液的制備
人工唾液和瘤胃液以體積比4:1的比例混合后,通人CO2,并置于39℃水浴鍋中備用。
1.8.4 生物飼料培養(yǎng)
稱取粉碎(2mm)的風(fēng)干樣品1g,分別置于體積為128mL的培養(yǎng)瓶中,稱取50mL的培養(yǎng)液注入培養(yǎng)瓶內(nèi),通入氮氣保持厭氧環(huán)境,立即蓋上膠蓋,并用專用封口鉗子壓緊鋁蓋,將培養(yǎng)瓶置于恒溫震蕩水浴鍋內(nèi),39℃震蕩培養(yǎng)48h。
1.8.5 干物質(zhì)消失率、pH及甲烷測定
根據(jù)Cao Y的方法,分別對培養(yǎng)后樣品的干物質(zhì)消失率、培養(yǎng)液的pH以及甲烷進行了測定。
1.9 數(shù)據(jù)處理
試驗采用SAS9.0軟件對4組秸稈生物發(fā)酵飼料水分、pH、in vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成量的數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較。
2結(jié)果與分析2.1 感官評定
各組玉米秸稈經(jīng)30 d發(fā)酵處理,其中無添加處理的玉米秸稈顏色為褐黃色、松軟不粘手、有酒酸味,無發(fā)霉現(xiàn)象。經(jīng)其他3種處理的玉米秸稈質(zhì)地柔軟、疏松稍濕潤,松軟不粘手,無發(fā)霉現(xiàn)象,顏色為黃色,有淡酸味。結(jié)果見表1。根據(jù)玉米秸稈青貯感官評價標準,得出各處理的感官評分均在51分以上(總分100分)。屬于良好的黃貯玉米秸稈。
2.2 秸稈生物發(fā)酵的水分與pH
玉米秸稈經(jīng)過無添加、M、LAB、M+LAB 4種處理后的水分和pH見表2。4種處理水分含量關(guān)系為LAB>無添加>M>M+LAB,各處理間差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)過LAB、M+LAB處理后的pH顯著(P<0.05)低于糖蜜處理組。
2.3 秸稈生物發(fā)酵飼料的微生物組成及數(shù)量
發(fā)酵玉米秸稈飼料中微生物組成及數(shù)量見表3。乳酸菌在4個處理組中的數(shù)量為106~107(cfu·g-1);大腸桿菌僅在無添加組檢測出106(cfu·g-1);好氧菌在4個試驗處理組中的數(shù)量為106~107(cfu·g-1);耐熱細菌在添加組和對照組中的數(shù)量分別為103和105(cfu·g-1);酵母菌在和M添加組中的數(shù)量為106(cfu·g-1),而在LAB和M+LAB添加組中為102(cfu·g-1);在添加組和對照組均沒有發(fā)現(xiàn)酪酸菌和霉菌。
2.4 In Vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成量
不同處理對秸稈飼料體外培養(yǎng)干物質(zhì)消失率和甲烷生成量的影響見表4。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加組的干物質(zhì)消失率顯著高于無添加組(P<0.05),而乳酸菌添加組的甲烷生成量顯著低于無添加組和糖蜜添加組(P<0.05)。
3討論試驗從水分、pH、色澤、氣味、質(zhì)地等方面分別對無添加、M、LAB、M+LAB 4種處理的發(fā)酵玉米秸稈進行感官評定。經(jīng)30 d發(fā)酵后,無添加處理的玉米秸稈顏色為褐黃色、質(zhì)地松軟不粘手、有淡酸味,無發(fā)霉現(xiàn)象;經(jīng)其他三種處理的玉米秸稈質(zhì)地疏松稍濕潤、不粘手,無發(fā)霉現(xiàn)象,顏色為黃色,有醇香味。各處理的感官評分均在51分以上,屬于良好的黃貯玉米秸稈。但是,試驗為黃貯玉米秸稈,而感官評定中參考的是玉米秸稈青貯感官評價標準,所以水分含量比青貯玉米水分含量稍低。其中,LAB和M+LAB處理的玉米秸稈感官評分最高,而M的處理評分次之,這說明LAB處理對發(fā)酵玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)有益。
青貯秸稈的發(fā)酵品質(zhì)主要由pH值和有機酸含量(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)等決定。pH是評價青貯飼料品質(zhì)最簡單且最直觀的指標之一,pH越低,有機酸含量越高,青貯越容易保存。玉米秸稈發(fā)酵時,水分越高,發(fā)酵品質(zhì)越差,試驗中各個處理的水分都在60%左右,故發(fā)酵效果較好。同時,pH的高低也是判斷風(fēng)干玉米秸稈青貯是否成功的重要指標,當青貯玉米秸稈的pH在4.0以下時,青貯質(zhì)量為優(yōu)等;當pH在4.1~4-3時,青貯質(zhì)量較為良好;當pH在4.4~5.0時,青貯質(zhì)量較為一般;而當pH在5.0以上時,青貯質(zhì)量則為劣等。由此可見,試驗中無添加組黃貯玉米秸稈質(zhì)量較為一般,LAB、M+LAB處理組的pH顯著下降,發(fā)酵質(zhì)量較好,發(fā)酵玉米秸稈青貯中的有害微生物處于被抑制狀態(tài)。
玉米秸稈黃貯中,乳酸菌是具有重要作用的益生菌,其種類和數(shù)量對發(fā)酵玉米秸稈品質(zhì)有很大影響;酵母菌能夠提高奶牛干物質(zhì)采食量,產(chǎn)奶量以及消化粗蛋白和酸性洗滌纖維的能力;而霉菌是飼料中的有害菌,不僅會造成飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失,還會危害家畜和人的健康。一般情況下,發(fā)酵品質(zhì)良好的飼料,由于pH較低,會抑制微生物包括乳酸菌的活性。
試驗中,4種發(fā)酵飼料的乳酸菌均在106~107之間,說明試驗所用的玉米秸稈附著一定數(shù)目的乳酸菌,并且由于乳酸菌的耐酸性較強,在密封發(fā)酵的過程中能夠進行繁殖。添加高效產(chǎn)酸LAB后,發(fā)酵飼料中可溶性糖生成乳酸,降低pH,抑制了酵母菌活性,大腸桿菌和霉菌被完全抑制。所以,在LAB添加組中,乳酸菌有輕微的減少,而酵母菌明顯減少,這與以前對發(fā)酵稻草的研究結(jié)果相似。
飼料在發(fā)酵過程中,乳酸菌利用原料中的可溶性糖生成乳酸,降低pH,抑制有害微生物,減少養(yǎng)分損失。改變了碳水化合物的組成和降解特性,而碳水化合物的組成和降解特性在很大程度上決定了瘤胃內(nèi)甲烷的生成量。根據(jù)甲烷生成量的預(yù)測模型:甲烷生成量(g·d-1)=91+50x可消化纖維素(kg·d-1)+40x可消化半纖維素(ks·d-1)+24x可消化淀粉(kg·d-1)+67x可消化糖(kg·d-1)(R2=0.84)。通常發(fā)酵飼料中的乳酸菌和其他菌類很容易發(fā)酵分解糖分、淀粉及一部分纖維素,轉(zhuǎn)變?yōu)榫w蛋白等并生成有機酸,降低了飼料中一部分碳水化合物,即改變了碳水化合物組成,并且發(fā)酵生成的有機酸可以直接被瘤胃或微生物吸收利用,使他們不參與瘤胃內(nèi)發(fā)酵,可能導(dǎo)致甲烷生成量減少。
試驗中,盡管糖蜜和乳酸菌共同添加可以促進秸稈生物飼料乳酸發(fā)酵,降低pH,減少養(yǎng)分損失,進而提高干物質(zhì)消失率。但由于添加糖蜜增加了飼料中的可消化糖分,便導(dǎo)致瘤胃甲烷生成量的增加。如上所述,乳酸菌添加后,可以分解秸稈中可溶性糖生成乳酸,減少了甲烷生成量等式中的可消化糖的含量,進而降低瘤胃甲烷的生成。
4結(jié)論添加乳酸菌以及LAB+M可以降低pH,抑制有害微生物的生長,減少飼料養(yǎng)分損失,促進玉米秸稈生物飼料發(fā)酵。同時添加乳酸菌也可以提高體外培養(yǎng)干物質(zhì)消失率,減少瘤胃甲烷生成。
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