3.4 正交試驗(yàn)

發(fā)酵工藝優(yōu)化采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，各參數(shù)水平根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、酶添加量、料水比3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，隨后篩選出優(yōu)化組合。

3.5 檢測方法

硫苷含量檢測采用氯化鈀分光光度法；硫苷分解產(chǎn)物異硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）含量檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 13087-91.GB 13089-91；單寧含量檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15686-2008；植酸含量檢測采用分光光度法；粗蛋白含量檢測采用凱氏定氮法；菜籽肽含量檢測：稱取過80目篩的待測樣品，加入等體積10％三氯乙酸（TCA），在160r/min下振蕩30min，而后4000r/min離心15min，取上清液采用Folin一酚法測定蛋白質(zhì)總量；菜粕蛋白分布采用SDS—PAGE凝膠電泳；還原糖含量檢測采用DNS分光光度法；鈣含量檢測參照GB／T 13885—2003，磷含量檢測參照GB/T 6437—2002。

4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，多重比較采用LSD法，顯著水平為P<0.05。

結(jié)果與分析

1 菌酶協(xié)同酵解菜粕方式的確定(見表2)

由表2可知，處理方式3，即菌酶同步發(fā)酵，在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面，同時(shí)取得較好的效果，硫苷降解率達(dá)到68.10％，菜籽肽含量為140.78mg／g，比發(fā)酵前提高了3.21倍。而處理4，即菌酶分步發(fā)酵方式，雖然菜籽肽含量的提高效果明顯，但硫苷降解效果較差。因此，選擇菌酶同步添加的方式進(jìn)行協(xié)同酵解后續(xù)的單因素試驗(yàn)。

2 菌酶協(xié)同酵解條件研究

2.1 接種量對菜籽肽含量的影響(見圖1)

隨著接種量的增加，菜籽肽含量呈現(xiàn)先增加、后下降的變化過程。當(dāng)接種量為1.5％時(shí)，菜籽肽含量達(dá)156.4mg／g，接種量為2％時(shí)，菜籽肽含量達(dá)164.3mg／g，增加幅度不大，因此本試驗(yàn)選擇適宜接種量為1.5％。

2.2 酶添加量對菜籽肽含量的影響(見圖2）

圖2表明，當(dāng)中性蛋白酶添加量為100U／g時(shí)，菜籽肽含量達(dá)到161.2mg／g；當(dāng)酶添加量為250U／g時(shí)，菜籽肽含量最高，達(dá)166.4mg／g，與添加100U／g相比，增加幅度不大，考慮到加酶成本，本試驗(yàn)確定酶的適宜添加量為100U／g。

2. 3 料水比對菜籽肽含量的影響(見圖3）

結(jié)果表明，隨著發(fā)酵體系中水分含量的增加，菜籽肽含量呈逐漸增加的趨勢，但考慮到含水率增加時(shí)，會(huì)顯著影響到硫苷的脫毒效果，而料水比在1：1、1：1.1和1：1.2時(shí)，對菜籽肽含量的影響不大，因此確定最適料水比為1：1。

2.4 菌酶協(xié)同酵解條件的正交試驗(yàn)

以菜籽肽含量為指標(biāo)，選取接種量、酶添加量和料水比進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)試驗(yàn)，因素水平編碼表和設(shè)計(jì)實(shí)施方案見表3。試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表4和表5。

正交試驗(yàn)的結(jié)果顯示，接種量、酶添加量和料水比3個(gè)因素中，酶添加量和接種量是影響小肽含量的顯著因素。3個(gè)因素對小肽含量的影響，依次為酶添加量>接種量>料水比。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳發(fā)酵條件為：接種量為1.0％，酶添加量為150U／g，料水比為1：1.0。

3 菌酶協(xié)同酵解菜粕營養(yǎng)成分分析

根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳條件，進(jìn)行菌酶協(xié)同酵解菜籽粕，并對處理前后的菜籽粕進(jìn)行了營養(yǎng)成分分析和蛋白凝膠電泳，結(jié)果見表6和圖4。

討論

菜籽粕中存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中硫苷是最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其含量較高。物理法和化學(xué)法脫毒存在耗能高、蛋白損失大、成本昂貴等缺陷限制了其使用，微生物發(fā)酵法脫毒因其在很多方面能克服物理和化學(xué)法的缺點(diǎn)而受到普遍的重視和應(yīng)用。本試驗(yàn)中，采用微生物發(fā)酵協(xié)同酶解處理后，菜籽粕中硫苷的降解率達(dá)74.23％，與黃茜等利用篩選獲得的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和釀酒酵母進(jìn)行菜粕發(fā)酵，得到硫苷的降解率達(dá)到89.06％的結(jié)果一致。同時(shí)，試驗(yàn)還表明，通過發(fā)酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。劉軍等從土壤中分離出若干霉菌、酵母菌和細(xì)菌，對其中3支菌株混合發(fā)酵，結(jié)果菜粕的粗蛋白含量提高了23％；國外Adarsh Palvigl利用少孢根霉發(fā)酵菜籽餅粕也發(fā)現(xiàn)蛋白含量得到增加。試驗(yàn)證實(shí)了微生物發(fā)酵是改良菜籽粕的有效手段。

目前，對植物源蛋白及活性肽的研究日益成為食品、醫(yī)藥及飼料等領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)中小肽含量比發(fā)酵前提高了3.7倍，菜籽粕中還原糖、Ca、P含量分別比發(fā)酵前提高了57.68％、26.83％和11.57％。同時(shí)SDS—PAGE蛋白凝膠電泳結(jié)果也表明，菜粕經(jīng)菌酶協(xié)同酵解后，蛋白組分中高于25kD的大分子蛋白得到了較充分的降解。據(jù)報(bào)道，用蛋白酶酶解制備菜籽肽，可得到分子量較小的小肽，且蛋白水解度較高。但作為飼料添加劑生產(chǎn)成本太高，同時(shí)酶解法對植物源蛋白中抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除效果并不理想。采用菌酶協(xié)同酵解法制備菜籽肽，枯草芽孢桿菌能分解其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子作為營養(yǎng)物質(zhì)供自身的生長，從而達(dá)到脫毒的效果，同時(shí)外源蛋白酶與微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶，將大分子量的蛋白降解為小分子量的蛋白肽，可有效提高菜粕的品質(zhì)及蛋白利用率，為菜籽粕的深入開發(fā)提供新的途徑。

結(jié)論

本試驗(yàn)對菌酶協(xié)同酵解生產(chǎn)高品質(zhì)菜粕的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，通過單因素及正交試驗(yàn)，確定了采用枯草芽孢桿菌與中性蛋白酶同步發(fā)酵的方式，當(dāng)接種量為1.0％，酶添加量為150U／g，料水比為1：1.0，發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時(shí)問為48h時(shí)，菜籽粕中硫代葡萄糖苷(硫苷)的降解率達(dá)74.23％，其分解產(chǎn)物異硫氰酸酯(ITC)和嗯唑烷硫酮(OZT)的含量分別比發(fā)酵前降低了79.07％和55.56％；發(fā)酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17％和16.39％；發(fā)酵后菜籽粕中粗蛋白含量達(dá)41.30％，比發(fā)酵前提高1.92％，菜籽肽含量達(dá)170.12mg/g，比發(fā)酵前提高了3.7倍，還原糖含量比發(fā)酵前提高了57.68％，鈣、磷含量分別比發(fā)酵前提高了26.83％和11.57％。同時(shí)，SDS—PAGE電泳結(jié)果表明，菌酶協(xié)同酵解工藝處理后，菜籽蛋白中大分子量亞基均得到較好的降解效果。

實(shí)戰(zhàn)操作技術(shù)——棉菜籽餅脫毒變身優(yōu)質(zhì)飼料替代豆粕操作新技術(shù)

當(dāng)前豆粕價(jià)格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價(jià)格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘?jiān)?，蛋白質(zhì)含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質(zhì)，這些物質(zhì)含有一定的毒性，還會(huì)影響動(dòng)物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動(dòng)物！

現(xiàn)在通過微生物飼料發(fā)酵劑的除毒脫毒技術(shù)，可以成功將菜籽餅變?yōu)閮?yōu)質(zhì)添加飼料，直接按照1公斤發(fā)酵的棉菜籽餅（發(fā)酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進(jìn)行使用。飼料發(fā)酵劑中的有益微生物，在發(fā)酵過程中分泌的代謝產(chǎn)物，可將棉菜籽餅中的毒性物質(zhì)等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質(zhì)含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報(bào)價(jià)每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點(diǎn)是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質(zhì)中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報(bào)價(jià)每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質(zhì)含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質(zhì)含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質(zhì)含量36.04%。精氨酸含量高達(dá)3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報(bào)價(jià)每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經(jīng)過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸，在不需要額外加入動(dòng)物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質(zhì)和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進(jìn)它們的營養(yǎng)吸收。只有當(dāng)其他粕類單位蛋白成本遠(yuǎn)低于豆粕時(shí)，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經(jīng)過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產(chǎn)生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質(zhì)。這些物質(zhì)可引起甲狀腺腫大，從而造成動(dòng)物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質(zhì)的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進(jìn)行一定的脫毒處理，并且使用時(shí)要加以限制，具體喂量應(yīng)根據(jù)菜粕中有害成分含量而定。經(jīng)過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產(chǎn)的菜粕喂量要受限制。同時(shí)，應(yīng)結(jié)合菜粕的氨基酸組成特點(diǎn)，適當(dāng)搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動(dòng)物有害的棉酚及環(huán)丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合而變成結(jié)合棉酚，結(jié)合棉酚在動(dòng)物消化道內(nèi)不被動(dòng)物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動(dòng)物毒性較大，尤其單胃動(dòng)物過量攝取或攝取時(shí)間較長，可導(dǎo)致生長遲緩、繁殖性能及生產(chǎn)性能下降，甚至導(dǎo)致死亡。幼小動(dòng)物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動(dòng)物有害，因此，在使用棉餅、粕時(shí)，要根據(jù)飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優(yōu)質(zhì)粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會(huì)造成中毒。對單胃動(dòng)物要限制喂量，最好使用經(jīng)過脫毒處理的棉籽餅粕。同時(shí)，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應(yīng)注意添加賴氨酸。

發(fā)酵操作技術(shù)

發(fā)酵棉菜籽餅其實(shí)也是一個(gè)脫毒技術(shù)，具體操作如下：

1.仔細(xì)檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴(yán)重變質(zhì)發(fā)霉的部分，輕度發(fā)霉的原料可以忽略，因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調(diào)節(jié)飼料營養(yǎng)比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發(fā)酵劑”1包（500g/包，市場售價(jià)約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復(fù)合酶制劑的專業(yè)發(fā)酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發(fā)酵方式根據(jù)實(shí)際環(huán)境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發(fā)酵均可。

6.發(fā)酵時(shí)要盡可能排盡空氣進(jìn)行密封發(fā)酵。如果使用的發(fā)酵容器有密封不嚴(yán)實(shí)的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發(fā)酵過程中不能啟封。

7.發(fā)酵時(shí)間受環(huán)境溫度影響，通常夏季發(fā)酵2-3天，冬季發(fā)酵5-7天即可完成。發(fā)酵完成后，有較為強(qiáng)烈的酸香味，ph值在3-4。

規(guī)模運(yùn)用混合發(fā)酵現(xiàn)場

塑料缸、飼料袋（有內(nèi)膜）均可做發(fā)酵飼料

采用池子發(fā)酵

發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動(dòng)物技術(shù)

需要注意的是，發(fā)酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時(shí)根據(jù)不同情況，將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕（濕料）代替動(dòng)物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時(shí)，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發(fā)酵過程中與發(fā)酵后使用過程中，發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài)，可以長時(shí)間保存（一年左右）。

當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價(jià)原料發(fā)酵飼料（包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價(jià)收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料，將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時(shí)發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。

本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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