２.２　分離株的生化及ＰＣＲ鑒定

對(duì)該分離株進(jìn)行硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、糖發(fā)酵等試驗(yàn)，其鑒定結(jié)果如表１。從菌落形態(tài)以及生化反應(yīng)結(jié)果來看，該菌株的特征與丁酸梭菌是一致的，初步鑒定該分離株為丁酸梭菌。

提取丁酸梭菌分離株的基因組，以其為模板進(jìn)行１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后結(jié)果見圖２，可見一條大小為１?。担埃埃猓鹱笥业奶禺愋詶l帶，與預(yù)期條帶大小相符。將目的條帶進(jìn)行膠回收純化和核苷酸測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在ＮＣ－ＢＩ數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對(duì)，結(jié)果表明，該菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列與丁酸梭菌（ＮＣＢＩ登錄號(hào)：ＫＣ１９６７７７.１）同源性達(dá)１００％，因此確定該分離株為梭菌屬丁酸梭菌。

２.３　丁酸梭菌抑制致病菌的能力

丁酸梭菌培養(yǎng)上清液抑制致病菌能力的結(jié)果見表２和表３。其中表２為牛津杯法測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照組是ＲＣＭ培養(yǎng)液，其抑菌圈直徑為０ｍｍ，對(duì)致病菌無抑制作用，而丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌后，抑菌圈直徑分別為２５.０、２６.３、２８.４ｍｍ。由此可知，丁酸梭菌培養(yǎng)上清對(duì)這３種致病菌均有良好的抑制作用，其中對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用最強(qiáng)。

活菌計(jì)數(shù)法試驗(yàn)結(jié)果見表３。由表３可知，與丁酸梭菌培養(yǎng)上清液和大腸桿菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用大腸桿菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分別提高了５３.３３％、５６.６７％、６８.３３％、７８.３３％；與丁酸梭菌培養(yǎng)上清液和豬霍亂沙門氏菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用豬霍亂沙門氏菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分別提高了５６.６７％、６０.３３％、６９.６７％、７８.６７％；與丁酸梭菌培養(yǎng)上清液和鼠傷寒沙門氏菌作用０ｍｉｎ相比，丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用鼠傷寒沙門氏菌５、１５、３０、６０ｍｉｎ后抑菌力分別提高了５９.６７％、６１.３３％、７０.３３％、８３.３３％，并且隨著丁酸梭菌培養(yǎng)上清液作用時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)這３種致病菌的抑制作用均有所增強(qiáng)。由此可見，牛津杯法和活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定丁酸梭菌抑菌能力的試驗(yàn)結(jié)果是一致的。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，丁酸梭菌能夠有效抑制３種致病菌的生長(zhǎng)，抑制作用由強(qiáng)到弱依次為鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和大腸桿菌。

２.４　丁酸梭菌對(duì)ＩＰＥＣ－Ｊ２生長(zhǎng)的影響

用不同劑量的丁酸梭菌處理ＩＰＥＣ－Ｊ２細(xì)胞３ｈ，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，當(dāng)ＭＯＩ為０、１、１０和５０時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況均良好，表現(xiàn)為細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清，當(dāng)ＭＯＩ為１００時(shí)，細(xì)胞折光性降低、輪廓增強(qiáng)、細(xì)胞之間空隙增大、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，少量細(xì)胞甚至死亡，漂浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中。由此可見，ＭＯＩ為１、１０和５０時(shí)丁酸梭菌對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)無可見影響，當(dāng)ＭＯＩ為１００時(shí)，丁酸梭菌會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，造成細(xì)胞損傷甚至死亡。顯微鏡觀察后，將細(xì)胞消化收集，并進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖３。由圖３可知，與對(duì)照組相比，ＭＯＩ為１、１０和５０時(shí)試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)均無顯著差異，ＭＯＩ為１００時(shí)試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)顯著降低（Ｐ＜０.０５），由此可見，丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１００時(shí)影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

２.５　丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２的能力

不同作用時(shí)間對(duì)丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的影響見表４。由表４可知，與丁酸梭菌作用細(xì)胞３ｈ相比，丁酸梭菌作用細(xì)胞６、１２ｈ，其黏附指數(shù)分別增加４.９％、４.０％，丁酸梭菌作用２４ｈ時(shí)，黏附指數(shù)降低了１.８％，無顯著差異（Ｐ＞０.０５），其中作用時(shí)長(zhǎng)為６ｈ時(shí)丁酸梭菌黏附細(xì)胞的數(shù)量最多，說明丁酸梭菌對(duì)豬腸上皮細(xì)胞具有很好的黏附性。不同作用濃度對(duì)丁酸梭菌黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２能力的影響見表５。由表５可知，與ＭＯＩ為１相比，ＭＯＩ為１０、５０、１００時(shí)，丁酸核菌的黏附能力均顯著增加（Ｐ＜０.０５），且以ＭＯＩ為５０時(shí)丁酸梭菌的黏附能力最強(qiáng)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ＭＯＩ為１００時(shí)，較多的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，并伴有部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中，因此，丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１００時(shí)對(duì)細(xì)胞具有損傷作用。

２.６　丁酸梭菌對(duì)致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２的影響

丁酸梭菌對(duì)致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２的影響結(jié)果見表６。由表６可知，與大腸桿菌刺激細(xì)胞０ｈ相比，大腸桿菌刺激細(xì)胞３、６、１２和２４ｈ時(shí)，其黏附數(shù)分別降低了１１％、３６％、４３％和２５％；與豬霍亂沙門氏菌刺激細(xì)胞０ｈ相比，豬霍亂沙門氏菌刺激細(xì)胞３、６、１２和２４ｈ時(shí)，其黏附數(shù)分別降低了２５％、４０％、５０％和１７％；與鼠傷寒沙門氏菌刺激細(xì)胞０ｈ相比，鼠傷寒沙門氏菌刺激細(xì)胞３、６、１２和２４ｈ時(shí)，其黏附數(shù)分別降低了３５％、４７％、５５％和１６％；并且３種致病菌均以作用細(xì)胞１２ｈ時(shí)其黏附數(shù)降低為最多。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，丁酸梭菌能夠有效抑制３種致病菌黏附ＩＰＥＧ－Ｊ２，其抑制效果由強(qiáng)到弱依次是鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌。

２.７　丁酸梭菌對(duì)ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響

丁酸梭菌對(duì)ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響見圖４，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１時(shí)，ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的濃度均沒有顯著變化（Ｐ＞０.０５）；丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為１０時(shí)，ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的濃度均顯著增加（Ｐ＜０.０５），而ＩＬ－１β的濃度沒有顯著變化（Ｐ＞０.０５）；丁酸梭菌處理濃度ＭＯＩ為５０和１００時(shí)，ＩＬ－１β、ＩＬ－８和ＴＮＦ－α的濃度均顯著增加（Ｐ＜０.０５）。

本研究分別采用牛津杯法和活菌計(jì)數(shù)法分析獲得丁酸梭菌分離株抑菌活性，結(jié)果表明丁酸梭菌分離株對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均具有很強(qiáng)的抑制作用。已有研究表明，丁酸梭菌可能通過丁酸、抗菌肽等物質(zhì)抑制致病菌的生長(zhǎng)。賈麗楠等研究表明，丁酸梭菌發(fā)酵液上清對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等均具有明顯的抑制作用，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，起抑菌作用的為有機(jī)酸、蛋白或多肽類物質(zhì)。威脅斷奶仔豬腸道健康的致病菌除大腸桿菌和沙門氏菌外，還有其他病原菌如丹毒桿菌和鏈球菌等，因此，丁酸梭菌對(duì)于其他動(dòng)物腸道病原菌的生長(zhǎng)繁殖是否具有抑制作用還有待進(jìn)一步研究。

３.２　丁酸梭菌黏附及競(jìng)爭(zhēng)性黏附能力

本研究的３種腸道致病菌均是通過定植于動(dòng)物腸道產(chǎn)生一些對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有害的產(chǎn)物，從而導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病。大腸桿菌主要通過菌毛及纖毛蛋白結(jié)構(gòu)中的黏附因子定殖于小腸黏膜并與小腸黏膜上皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，釋放腸毒素引起腹瀉。沙門氏菌是引起６個(gè)月以下仔豬副傷寒的主要病原菌，菌體表面有菌毛，利于菌體在黏膜及組織細(xì)胞上黏附，不利于病原菌的清除。

丁酸梭菌發(fā)揮益生作用主要是通過定植在細(xì)胞表面后競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和黏附部位，從而阻擋病原菌與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，達(dá)到抑制致病菌黏附細(xì)胞的目的，在一定程度上降低致病菌的增殖。由于在動(dòng)物體內(nèi)很難準(zhǔn)確的判定細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力，因此應(yīng)用體外細(xì)胞試驗(yàn)研究細(xì)菌的黏附能力是目前最常用的方法。本研究采用ＩＰＥＣ－Ｊ２為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用丁酸梭菌分離株作用細(xì)胞后檢測(cè)其黏附能力。利用不同濃度的丁酸梭菌黏附細(xì)胞，檢測(cè)黏附數(shù)的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌對(duì)腸上皮細(xì)胞具有較好的黏附性，結(jié)合丁酸梭菌對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響及其黏附細(xì)胞的結(jié)果，最終確定丁酸梭菌的最佳ＭＯＩ為５０。本研究中發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌ＭＯＩ為１００時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞損傷甚至死亡，并且丁酸梭菌的黏附數(shù)會(huì)下降，可能是因?yàn)槎∷崴缶a(chǎn)生丁酸等代謝產(chǎn)物使細(xì)胞培養(yǎng)液的ｐＨ降低，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響。用丁酸梭菌的最佳感染濃度處理細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，丁酸梭菌黏附細(xì)胞的能力增加，但是其黏附數(shù)差異并不顯著，為縮短試驗(yàn)周期，后續(xù)試驗(yàn)選擇黏附的最適時(shí)長(zhǎng)為３ｈ，當(dāng)作用時(shí)間為２４ｈ時(shí)，丁酸梭菌黏附能力下降，這可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用盡，也可能是由于細(xì)胞表面的黏附受體有限，導(dǎo)致丁酸梭菌黏附數(shù)達(dá)到飽和導(dǎo)致黏附率下降，關(guān)于這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因目前在丁酸梭菌上研究較少，需要進(jìn)一步研究。

梁東梅等研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌、唾液乳桿菌、嗜酸乳桿菌均在作用細(xì)胞２４ｈ時(shí)黏附能力開始下降，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。劉海鴻等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌在作用２和４ｈ時(shí)黏附能力開始下降，本試驗(yàn)結(jié)果與此不同。這種黏附效果和細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的差異可能是由于試驗(yàn)菌株類型、使用菌株濃度及其代謝產(chǎn)物、使用細(xì)胞類型等不同造成的。丁酸梭菌抑制致病菌黏附結(jié)果表明，丁酸梭菌能夠顯著抑制致病菌黏附，這主要可能是由于丁酸梭菌競(jìng)爭(zhēng)性黏附細(xì)胞以后占據(jù)了黏附位點(diǎn)，抑制致病菌與腸上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合。但是當(dāng)致病菌作用時(shí)間達(dá)到２４ｈ時(shí)，丁酸梭菌的抑制能力降低，這可能是由于致病菌釋放的內(nèi)毒素等有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，影響了細(xì)胞及益生菌的正常生理功能。

３.３　丁酸梭菌對(duì)ＩＰＥＣ－Ｊ２免疫應(yīng)答的影響

丁酸梭菌作為飼料添加劑，可以通過激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，增加免疫球蛋白ＩｇＡ和ＩｇＭ的含量，激活自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而提高機(jī)體的免疫能力。炎癥細(xì)胞因子是一類可以調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)的多肽類物質(zhì)總稱。ＩＬ－８主要由單核－巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物，這些活性物質(zhì)導(dǎo)致機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)，達(dá)到殺菌目的，但是釋放較多會(huì)引起細(xì)胞損傷。ＩＬ－１β促進(jìn)Ｂ細(xì)胞增殖和分泌抗體，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與組織修復(fù)等。ＴＮＦ－α是機(jī)體重要的炎性因子，它的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，殺傷腫瘤細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，參與組織損傷修復(fù)等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌可以上調(diào)炎癥因子ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α基因的表達(dá)。楊靜試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著丁酸梭菌及磷壁酸處理濃度的增加，促炎因子ＩＬ－８的ｍＲＮＡ表達(dá)量增加，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。張傳健研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌組和抗生素組均能提高ＴＮＦ－α的含量，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。由此可見，丁酸梭菌對(duì)動(dòng)物腸道免疫起到一定的刺激作用，這種微弱的刺激可引起適量炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，不會(huì)損傷腸上皮細(xì)胞的完整性，有利于增強(qiáng)腸道黏膜免疫防御功能，對(duì)動(dòng)物腸道健康有一定的積極作用。

綜上所述，分離得到的丁酸梭菌培養(yǎng)上清能夠抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)，且丁酸梭菌對(duì)豬腸上皮細(xì)胞具有良好的黏附能力，能夠有效抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的黏附，為丁酸梭菌在仔豬日糧中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并且探索出了丁酸梭菌作用細(xì)胞的合適濃度和時(shí)長(zhǎng)，為深入研究丁酸梭菌調(diào)節(jié)仔豬腸道健康機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

４　結(jié)　論

本研究從健康斷奶仔豬糞便中成功分離到一株丁酸梭菌，該分離株能夠顯著抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)，能夠黏附ＩＰＥＣ－Ｊ２且能抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌的黏附，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，激活ＩＰＥＣ－Ｊ２的免疫反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物腸道健康有一定的積極作用。

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