飼料霉菌毒素的生物降解研究表明發(fā)酵脫毒是成為飼料的有效方法
摘要: 霉菌毒素是由真菌合成的具有高毒性的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于飼料和飼料原料中。霉菌毒素在給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的同時，其在畜產(chǎn)品中的殘留也嚴重威脅著人體的健康。傳統(tǒng)的物理法和化學法是利用吸附劑、射線照射或化學反應來吸附或破壞毒素的分子結構，實現(xiàn)對霉菌毒素的脫毒。但該類技術存在去除率低以及可能會造成輻射污染和飼料中的營養(yǎng)成分流失等缺陷。而且，化學物質(zhì)殘留還會影響飼料品質(zhì)。生物降解方法因綠色、高效等優(yōu)勢逐漸成為霉菌毒素脫毒研究中的重要方向。本文總結了污染飼料的霉菌毒素種類，并綜述了近年來國內(nèi)外霉菌毒素的生物降解研究進展，可為飼料霉菌毒素的生物脫毒技術研究和應用提供參考。
霉菌毒素又稱真菌毒素，是鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)等真菌的次級代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸和誘變等毒性。霉菌毒素污染在世界各地的飼料和飼料原料中廣泛存在，不僅對直接攝入受污染飼料的動物具有毒害作用，還會隨動物產(chǎn)品(如肉、蛋、奶等)進入人體，進而危害人體健康。開發(fā)能夠消除飼料中霉菌毒素污染的高效、無污染技術是飼料工業(yè)和禽畜養(yǎng)殖行業(yè)的迫切需求。本文總結了污染飼料的主要霉菌毒素種類，在此基礎上綜述了利用生物法降解霉菌毒素的研究進展，為未來飼料中霉菌毒素的生物脫毒相關研究及應用提供理論和實踐依據(jù)。
1、飼料中的主要霉菌毒素
污染飼料和飼料原料的霉菌毒素主要包括黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、單端孢霉烯族毒素(trichothecenes，TCT)、伏馬菌素(fumonisins，F(xiàn)Bs)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)等。飼料在實際加工和儲存過程中常會受到多種毒素的共污染，毒素之間的相互作用可導致更嚴重的毒性效應。
1.1 AFB1
黃曲霉毒素是曲霉屬真菌的次級代謝產(chǎn)物，主要污染谷物、玉米麩和雜粕等。黃曲霉毒素發(fā)揮毒性作用的主要部位是分子末端的呋喃環(huán)、香豆素結構和內(nèi)酯環(huán)。目前，超過75%的飼料污染均是由毒性最大的AFB1引起的。研究表明，AFB1在動物體內(nèi)的代謝能夠破壞基因和細胞結構并影響代謝。國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)已將AFB1列為Ⅰ類致癌物。
1.2 ZEN
ZEN是由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的具有雌激素作用的次級代謝物，主要污染玉米、大麥和高粱。ZEN及其代謝產(chǎn)物具有與17-β雌二醇相似的結構，可競爭性地結合生殖器官中的雌激素受體，進而干擾雌激素在性腺中的表達和功能，導致動物生殖障礙。此外，ZEN還具有遺傳毒性、肝臟毒性、血液毒性，已被IARC列為Ⅲ類致癌物。
1.3 TCT
TCT是由鐮刀菌等產(chǎn)生的倍半萜霉菌毒素家族，其分子是由環(huán)己烯、四氫吡喃和環(huán)戊基部分組成的三環(huán)狀結構。嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)和T-2毒素是飼料中污染最嚴重的2種TCT。DON屬于B類TCT，存在于玉米、豆粕等飼料原料及動物全價飼料中。環(huán)氧結構以及C3、C7和C15位的羥基都是其毒性基團。豬對DON最敏感，雞、鴨以及成年反芻動物次之。人和動物攝入DON超標的食物會出現(xiàn)一系列中毒癥狀，甚至導致死亡。T-2毒素屬于A型TCT，也是毒性最高的一種，可損傷動物的腸道、腎臟等多個器官系統(tǒng)。
1.4 FBs
FBs是由串珠鐮刀菌等產(chǎn)生的霉菌毒素，是由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的雙酯化合物。FBs主要污染玉米、大豆等飼料原料和全價飼料，F(xiàn)B1和FB2是這其中污染最嚴重、毒性最大的2種。IARC已將FBs列為ⅡB類致癌物。
1.5 OTA
OTA是曲霉屬等真菌的次生代謝物，存在于飼料和飼料原料中，其分子結構為二氫香豆素通過氨鍵與β-苯基丙氨酸殘基相連。OTA在腎臟中積聚可導致動物出現(xiàn)體重下降等癥狀，已被IARC列為ⅡB類致癌物。
2、飼料霉菌毒素的生物降解方法
霉菌毒素對飼料和飼料原料的污染能夠發(fā)生在田間及儲存加工過程中?，F(xiàn)階段尚無有效方法避免飼料原料采收前的污染。因此，對飼料原料或飼料成品進行脫毒處理是保證飼料安全的重要步驟。傳統(tǒng)的物理和化學方法，如吸附劑吸附、射線照射以及化學反應降解等，雖然能在一定程度上夠消除霉菌毒素污染，但存在諸多缺陷。目前，市面上的吸附劑種類繁多、效果各異。Mitchell等研究表明，蒙脫石最高可以去除樣品中97%的AFB1, 但對DON、ZEN等弱極性毒素的吸附能力較差。Ameer等利用紫外線實現(xiàn)了對家禽飼料中OTA的降解。但紫外線對固體物質(zhì)的穿透能力較弱，導致該方法在實際應用中的脫毒效率較低，且可能會造成紫外線污染。此外，堿處理法能夠去除玉米中的FBs，但氫氧化鈉等化學物質(zhì)的殘留勢必會影響玉米的品質(zhì)及食用安全性。基于此，研究人員將目光轉(zhuǎn)移到了生物解毒方法上，即微生物降解法和酶降解法。
2.1 降解霉菌毒素的微生物
微生物在生長繁殖過程中能夠通過代謝或分泌的酶將霉菌毒素分子中的毒性基團破壞，生成無毒的產(chǎn)物。許多微生物，如芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和酵母菌屬等細菌和真菌以及混合菌群均對霉菌毒素具有降解能力。
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2.1.1 芽孢桿菌屬
芽孢桿菌屬是一類分布廣且對惡劣環(huán)境具有較強的抗逆性的微生物，具有益生作用的芽孢桿菌屬已被批準作為飼料添加劑。在已被鑒定出具有霉菌毒素降解能力的微生物中，芽孢桿菌屬占了1/2以上，且底物涵蓋了大部分飼料霉菌毒素種類。
Chen等發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)WF2020可有效降解濃度為1~8 mg/mL的AFB1。Watanakij等研究發(fā)現(xiàn)，從非洲槐豆中分離的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BCC 42005的胞外組分具有AFB1降解能力。除降解AFB1外，目前已有多種具有ZEN降解能力的芽孢桿菌被分離出來，且降解機制呈現(xiàn)出多樣性。Zhu等篩選獲得的芽孢桿菌S62-W能在24 h內(nèi)將200 μg/mL的ZEN完全轉(zhuǎn)化為ZEN-14-磷酸。Zhai等從動物腸道容物中篩選到一株可在厭氧條件下將ZEN轉(zhuǎn)化為α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)的產(chǎn)芽孢梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes)F39。
同時，對具有復雜結構的單端孢霉烯族類毒素，芽孢桿菌也表現(xiàn)出良好的降解效果。Ul Hassan等篩選到了多株對T-2毒素表現(xiàn)出降解能力的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和蜜梳狀孢類芽孢桿菌(Paenibacillus favisporus)。在OTA降解方面，Zhang等研究證明，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)E2對OTA的去除能力可達96.1%以上，產(chǎn)物可能是毒性較低的赭曲霉毒素α(OTα)。
2.1.2 乳桿菌屬
作為一類益生菌，乳桿菌屬微生物具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫力、促進消化等作用，已被世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織定義為“對宿主健康有益的微生物”。目前，其對多種霉菌毒素的降解能力也逐漸受到關注，拓寬了乳桿菌屬的應用范圍。Zhang等研究表明，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helviticus)FAM22155能夠在以麩皮為底物的固相發(fā)酵過程降解AFB1。Zƚoch等研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)能將ZEN轉(zhuǎn)化為毒性減弱的β-ZOL。此外，乳桿菌屬還表現(xiàn)出了對DON的脫毒能力。從人乳中分離的鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)能夠?qū)ON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON。
2.1.3 德沃斯氏菌屬(Devosia)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)
德沃斯氏菌屬和類諾卡氏菌屬微生物能夠通過對DON的C3位的氧化和異構化將其轉(zhuǎn)化為3-keto-DON和3-epi-DON，進而達到脫毒的效果。因此，這2類菌屬在DON解毒方面?zhèn)涫荜P注。Gao等鑒定出的具有DON轉(zhuǎn)化能力的德沃斯氏菌A6-243能在48 h內(nèi)將100 mg/L的DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON。本實驗室從土壤樣品中篩選到了具有DON降解能力的類諾卡氏菌ZHH-013，產(chǎn)物鑒定結果表明，DON被經(jīng)由3-keto-DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON。此外，該菌株還能進一步利用3-epi-DON，從而實現(xiàn)了對DON的徹底降解。
2.1.4 曲霉屬
曲霉屬真菌對多種霉菌毒素具有降解能力。Maxwell等研究證明，不產(chǎn)毒素的黃曲霉(Aspergillus flavus)對AFB1的降解率可達44%以上。Ji等獲得了具有較高ZEN降解活性的黑曲霉(Aspergillus niger)ZEN-S-FS10，對AFB1的降解率穩(wěn)定在95%以上。除天然菌株外，經(jīng)紫外誘變后的黑曲霉獲得了OTA降解能力，且產(chǎn)物的毒性得到了顯著降低。
2.1.5 酵母屬
酵母屬真菌在食品、醫(yī)療、畜牧等產(chǎn)業(yè)中均有廣泛應用。多種具有霉菌毒素降解能力的酵母屬真菌也被鑒定出來。Li等報道了多變假絲酵母(Candida versatilis)CGMCC 3790對AFB1的降解效果。Pan等對近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)ATCC 7330降解ZEN的能力進行了試驗研究，結果表明，該菌對ZEN的降解率可達97%，產(chǎn)物為β-ZOL。此外，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y-2對OTA的降解率也可達97.2%。
2.1.6 微生物菌群
除單一菌種外，微生物菌群能通過菌株間的協(xié)同效應實現(xiàn)對霉菌毒素的降解。Wang等從含有發(fā)霉玉米芯和玉米稈的農(nóng)業(yè)堆肥中鑒定出了可降解ZEN及其同源物的微生物菌群NZDC-6。微生物菌群C20能將DON高效轉(zhuǎn)化為3-keto-DON。Zhao等從蘑菇廢渣中分離出了能將FB1轉(zhuǎn)化為毒性較低的產(chǎn)物的微生物菌群SAAS79。此外，微生物菌群也表現(xiàn)出了廣譜霉菌毒素降解能力，為解決多種霉菌毒素的共污染問題開辟了新途徑。Wang等報道了具有AFB1和ZEN降解能力的微生物菌群TADC7。
2.1.7 其他降解菌株
除上述菌屬外，多種能夠特異性降解霉菌毒素的菌株也得到了鑒定。大腸桿菌(Escherichia coli)CG1061具有AFB1降解能力。鄧桃等篩選到的醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)對薏苡仁中ZEN的降解率達54.8%。多種微生物表現(xiàn)出了對DON的降解能力。He等從麥田土壤中分離到了在好氧和厭氧條件下均能對DON進行脫環(huán)氧的脫亞硫酸桿菌(Desulfitobacterium sp.)PGC-3-9。此外，Keawmanee等研究表明，黏質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)329-2能夠降解FB1。
2.2 霉菌毒素降解酶
微生物脫毒的本質(zhì)也是利用酶對霉菌毒素進行降解。與微生物法相比，酶降解法因具有易于操作、可重復和高效等優(yōu)點而受到重視。特別是隨著現(xiàn)代分子生物學技術及基因工程手段的發(fā)展，利用酶進行霉菌毒素脫毒成為研究熱點。目前已被鑒定出的霉菌毒素降解酶類主要包括氧化還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶及特異性降解酶等。
2.2.1 氧化還原酶
氧化還原酶是催化電子從供體轉(zhuǎn)移到受體的酶的總稱。該類酶具有底物譜廣、催化活性高等優(yōu)點。目前，利用氧化還原酶進行霉菌毒素降解的研究已經(jīng)逐漸成為該領域的前沿方向。Xiong等研究表明，解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)B10來源的漆酶對AFB1的降解率可達79.3%。Yamada等發(fā)現(xiàn)人源細胞色素P450酶家族成員3A4(CYP3A4)對AFB1的降解率可達98%。除對AFB1具有降解能力外，氧化還原酶對DON和FB1也表現(xiàn)出了降解活性。He等從德沃斯氏菌中挖掘到的DON脫氫酶可將DON氧化為3-keto-DON。Telmer等報道了一個黑曲霉來源的能夠氧化FBs的氨氧化酶。
基于其較寬的底物譜，氧化還原酶具有作為廣譜霉菌毒素降解酶高效降解多種霉菌毒素的應用潛力。Loi等研究表明，刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)來源漆酶在介體的協(xié)助下能夠降解AFB1、ZEN、T-2毒素、FB1及OTA。本實驗室在利用木質(zhì)素氧化還原酶和多銅氧化酶高效降解多種霉菌毒素方面的研究也已經(jīng)取得進展。Wang等研究證明，降解AFB1、ZEN、DON和FB1的能力是錳過氧化物酶的共性?？莶菅挎邨U菌來源的染料脫色過氧化物酶BsDyP和嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)來源多銅氧化酶StMCO均具有降解AFB1和ZEN等不同類型霉菌毒素的能力。
2.2.2 轉(zhuǎn)移酶
轉(zhuǎn)移酶是催化一種底物上的官能團轉(zhuǎn)移到另一種底物上的酶類，該類酶可通過對霉菌毒素進行修飾而實現(xiàn)脫毒。Poppenberger等報道了阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)來源的糖基轉(zhuǎn)移酶AtΜGT73C5能使DON C3位的羥基發(fā)生糖基化，從而消除其毒性。
2.2.3 水解酶
多種霉菌毒素分子均存在酯鍵、肽鍵等位點，利用水解酶破壞這些結構從而實現(xiàn)霉菌毒素的降解是一條可行的脫毒路徑。Pereyra等從能夠降解AFB1的枯草芽孢桿菌中鑒定出了編碼N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的aiiA基因。Yang等從黑曲霉的胞外酶中純化出一種DON水解酶，其對DON的降解率可達70%以上。
自ZEN內(nèi)酯水解酶ZHD101被首次報道以來，同類水解酶相繼被發(fā)現(xiàn)。在此基礎上，利用蛋白質(zhì)工程手段對該類酶進行分子改良以滿足實際應用要求的相關研究已見諸報道。Zhang等通過對蛋白質(zhì)的催化區(qū)域進行突變顯著提高了粉紅黏帚霉(Gliocladium roseum)來源內(nèi)脂酶ZENG的耐熱性。本實驗室通過理性設計使美洲瓶霉(Phialophora americana)來源的內(nèi)酯水解酶ZHD607的催化活性提高了3.4倍。這些研究不但增進了我們對該類酶的了解，也是其走向工業(yè)化的重要一步。
基于OTA分子內(nèi)的肽鍵，Xu等獲得的枯草芽孢桿菌CW14來源羧肽酶對其降解率可達71.3%。Luo等獲得的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)來源的氨基水解酶ADH3能夠完全降解OTA。
2.2.4 融合酶
通過將不同的特異性霉菌毒素降解酶進行融合來實現(xiàn)對多種霉菌毒素的降解也是一種解決霉菌毒素共污染問題的可行途徑。Azam等報道了具有ZEN和OTA降解能力的內(nèi)酯水解酶和羧肽酶融合酶ZHDCP。此外，ZEN水解酶和錳過氧化物酶的融合蛋白對AFB1和ZEN的降解率分別可達64.1%和46.2%。
2.2.5 其他特異性霉菌毒素降解酶
除上述已被明確分類的酶種外，許多特異性霉菌毒素降解酶也被鑒定出來。Xie等從泛菌(Pantoea sp.)T6的上清液中分離出一種AFB1降解酶，該酶能夠去除花生中48.5%的AFB1。Tang等從不動桿菌(Acinetobacter sp.)SM04中獲得了ZEN降解酶。這些酶的挖掘不但豐富了霉菌毒素降解酶的種類，也為新型霉菌毒素降解酶的挖掘工作提供了思路。
3、小結
開發(fā)能夠消除飼料中的霉菌毒素污染的高效、無污染技術是飼料工業(yè)和禽畜養(yǎng)殖行業(yè)的迫切需求。在已有的霉菌毒素解毒技術中，生物降解方法是飼料霉菌毒素脫毒應用中最具潛力的技術手段之一。目前已有多種具有霉菌毒素脫毒或減毒能力的微生物被鑒定出來。特別是乳桿菌等潛在的益生菌，在作為飼料添加劑方面有一定的應用前景。但霉菌毒素微生物降解技術仍處于研究的早期階段，如何提高微生物對應用環(huán)境的適應性以及微生物的添加對飼料品質(zhì)影響的評估都是亟待解決的問題。微生物對霉菌毒素的降解本質(zhì)上是酶在發(fā)揮作用。由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差、異源表達難等問題，已篩選到的霉菌毒素降解酶大多未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用。針對目前的困境，有必要結合蛋白質(zhì)工程技術對酶分子進行改良以增加酶對應用場景的適應性。于此同時，開發(fā)霉菌毒素降解酶高效表達系統(tǒng)并完善酶法脫毒效果及機制的研究評價體系，將促進霉菌毒素降解酶的商業(yè)應用。
飼料中的霉菌毒素污染多為幾種毒素的共同作用。不同毒素間的相互作用所造成的危害遠大于單一霉菌毒素的疊加毒性。因此，具有廣譜毒素降解能力的微生物(如芽孢桿菌)或微生物菌群以及氧化還原酶等更具飼料工業(yè)應用潛力。通過篩選廣譜霉菌毒素降解菌并對其中的解毒酶基因進行挖掘和異源表達也是霉菌毒素生物降解研究領域重要的發(fā)展方向。
具體發(fā)酵脫毒方法介紹如下
1噸飼料霉菌毒素、100公斤玉米粉、99多功能飼料發(fā)酵劑2包（酶菌復合發(fā)酵劑產(chǎn)品，500g/包，市場售價約25元/包）、食鹽2公斤，加入2-5公斤紅糖或糖蜜效果更好，清水約500公斤，控制物料含水量控制在55%左右，裝入塑料袋等能密封的容器中，物料應完全密封并且簡單壓實，當使用密封性不嚴的容器發(fā)酵時,外面應加套可扎緊密封的塑料袋，注意密封過程中不能拆開翻倒，在自然氣溫下密封發(fā)酵約15天，等有酒香氣或泥土味時表明發(fā)酵完成，即可飼喂。
發(fā)酵完成后，要做少量飼喂測試，進行飼喂少量動物觀察，如果連續(xù)飼喂3天動物無恙，則可按照下面的飼喂方法批量使用。
發(fā)酵完成的飼料不能直接單獨飼喂動物，要按照每220-250公斤發(fā)酵飼料（濕）代替100公斤豆粕（干）的比例進行與其他飼料混合后飼喂動物。其使用效果比直接使用豆粕效果更好，且使用后養(yǎng)殖場臭味氨氣少，消化吸收率提高，降低料耗和減少發(fā)病率效果都比較明顯。
發(fā)酵后霉菌飼料已經(jīng)完全脫毒，蛋白質(zhì)被分解為更易被魚消化吸收的小分子活性肽、寡肽，纖維素、果膠被降解為單糖和寡糖，同時代謝產(chǎn)生的多種消化酶、氨基酸、維生素、抑菌物質(zhì)、免疫增強因子以及其它一些菌體蛋白。
發(fā)酵一噸茶枯（干）一般可以代替約0.7噸左右的豆粕（干），飼喂效果是可以肯定很好且也是很安全的。
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