發(fā)酵飼料菌種配比篩選與發(fā)酵工藝優(yōu)化
摘要：試驗(yàn)通過選擇枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌和保加利亞乳桿菌作為混合發(fā)酵劑發(fā)酵全價(jià)飼料，可以進(jìn)一步提高飼料利用率。在確定三種菌最佳混合比例的基礎(chǔ)上，對(duì)飼料發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，探討鐵腳麻雞發(fā)酵飼料的最佳工藝，為提高養(yǎng)殖效益提供理論依據(jù)。
枯草芽孢桿菌是耗氧菌，發(fā)酵過程消耗大量的養(yǎng)分，維持厭氧的環(huán)境，促進(jìn)厭氧菌乳酸菌生長，同時(shí)也抑制有害耗氧菌的生長；乳酸菌主要是產(chǎn)酸，對(duì)飼料質(zhì)量起到關(guān)鍵性作用；酵母菌是兼性厭氧菌，生長環(huán)境較寬，能產(chǎn)酸和大量的菌體蛋白。三種菌種的功效各不相同，采用三種菌種的最佳的混合配比，能夠讓其發(fā)酵的飼料營養(yǎng)更平衡、更利于吸收。
1 材料與方法
1.1 材料
酵母菌、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌；YPD、LB、MRS培養(yǎng)基、超凈工作臺(tái)、搖床培養(yǎng)箱、發(fā)酵菌種、配合飼料等試驗(yàn)器材。
1.1.1 固體培養(yǎng)基
1）YPD固體每300mL水中蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖、葡萄糖：6g、3g、6g、6g、6g單獨(dú)滅菌,然后加入300mL無菌蒸餾水中在121℃滅菌。
2）LB固體每300mL水中蛋白胨、酵母粉、氯化鈉：3g、1.5g、3g，在121℃滅菌鍋中滅菌。
3）MRS固體體培養(yǎng)基18.9g/300mL在121℃進(jìn)行滅菌。
4）生理鹽水a(chǎn)c10.9%；Nacl:7.2g+800mL蒸餾水。
1.1.2 液體培養(yǎng)基
1）YPD液體。稱酵母浸膏1g加入80mL蒸餾水中溶解，葡萄糖2g加入20mL蒸餾水中溶解，分別滅菌溫度為121℃，后混合。
2）LB液體。酵母浸膏0.5g、蛋白胨1g、Nacl 1g，加無菌蒸餾水至100mL。
3）MBS液體。成品：5.224g/100mL加無菌蒸餾水，封口121℃無菌鍋滅菌。
1.2 試驗(yàn)方法
滅菌：將配制YPD、LB、MRS培養(yǎng)基（固液），3個(gè)10mL離心管、100μL、1mL規(guī)格槍頭、無菌生理鹽水等進(jìn)行滅菌；
分裝：打開無菌超凈工作臺(tái),三個(gè)10mL離心管做好標(biāo)記，分別加入YPD、LB、MRS液體培養(yǎng)基8mL；
接種：將酵母菌80μg、枯草芽孢桿菌80μL、乳酸桿菌80μL分別加入到含有對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的離心管中，并密封好；
培養(yǎng)：將酵母菌在28℃、15h、搖床培養(yǎng)、有氧，枯草芽孢桿菌：35℃、20h、搖床培養(yǎng)、有氧，乳酸桿菌：37℃、15h、靜置培養(yǎng)、無氧。
1.3 觀察與計(jì)數(shù)
培養(yǎng)時(shí)間到后，取出進(jìn)行染色鑒定、計(jì)數(shù)。酵母菌用美蘭染色法，枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌用革蘭氏染色法，染色結(jié)束后進(jìn)行鏡鑒。
2 結(jié)果與分析
2.1 菌種最佳配比濃度的篩選
2.1.1 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果
本研究所使用的酵母菌在有氧條件下28℃搖床培養(yǎng)15h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，枯草芽孢桿菌在有氧條件下35℃搖床培養(yǎng)20h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，乳酸桿菌37℃靜置培養(yǎng)15h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，原菌液的含菌量結(jié)果如表1所示。
2.1.2 菌種活化與濃度梯度配制
將三種菌的含菌量分別設(shè)三個(gè)水平（見表2），按L₉（3⁴）的正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)。最后將不同配比的三種菌按1%的接種量接種到飼料中，在常溫下進(jìn)行為期7天的發(fā)酵。飼料水分含量為45%。具體接種方法為：將底料與菌種混勻后裝入500mL罐頭瓶中進(jìn)行發(fā)酵，每個(gè)罐頭瓶裝發(fā)酵料200g，發(fā)酵完成后對(duì)發(fā)酵飼料的質(zhì)地、顏色、氣味等進(jìn)行感官評(píng)定及菌落計(jì)數(shù)。
結(jié)合發(fā)酵飼料感官評(píng)定和活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果，初步得出發(fā)酵用菌種配比為：酵母菌1.8×108cfu/mL、乳酸菌1.35×108cfu/mL、枯草芽孢桿菌4×1011cfu/mL。
2.2 混菌一次發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果
2.2.1 發(fā)酵工藝設(shè)置與優(yōu)化
本試驗(yàn)先活化三種菌，分別獲取乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌，將三種活化菌分別制配成最佳菌種配比為酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL，在最佳菌種配比的條件下，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、飼料水分、微生物接種量4個(gè)因素為考察因子，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，按L₉（3⁴）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9種組合，每種組合做3次重復(fù)，最后以活菌數(shù)做為評(píng)判指標(biāo)。
2.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定
稱取0.6ｇ發(fā)酵飼料至裝有5.4mL無菌生理鹽水的10mL離心管中，在振蕩器上充分震蕩30min，用滅菌吸管吸取10ml至滅菌空試管中，在漩渦混合器上震蕩 3min，然后吸取1mL加入到9ml無菌生理鹽水中，在漩渦混合器上混合1min，進(jìn)行10倍系列釋，選取3個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，傾注平板，每個(gè)梯度做兩個(gè)平行，恒溫培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，算出發(fā)酵飼料中的活菌數(shù)。發(fā)酵結(jié)束后，仔細(xì)觀察，可見發(fā)酵第五天飼料質(zhì)地松軟、顏色為黃色，香味淡香為最佳。通過對(duì)發(fā)酵飼料的質(zhì)地、顏色、氣味等進(jìn)行感官評(píng)定及菌落計(jì)數(shù)，并進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)分的檢測(cè)，得出來水分含量為45%時(shí)，發(fā)酵的飼料比較好；溫度在25℃-30℃的時(shí)候發(fā)酵較好，此時(shí)產(chǎn)生的活菌數(shù)和活性物質(zhì)含量達(dá)到最優(yōu)。
3 結(jié)論
綜上所述，最佳菌種配比為酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL；鐵腳麻雞育肥期飼料發(fā)酵最佳工藝為發(fā)酵溫度為25-30℃，發(fā)酵時(shí)間為5天，飼料含水量為45%。
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