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導(dǎo)讀

大腸桿菌Nissle 1917(EcN)(血清型為06：K5：H1)是一株被德國(guó)醫(yī)生Alfred Nissle在一戰(zhàn)期間發(fā)現(xiàn)并分離得到的無(wú)致病性的革蘭氏陰性益生菌 。EcN的益生功能與其對(duì)腸道微生物的調(diào)控和腸道內(nèi)細(xì)胞因子引起免疫反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)。EcN通過(guò)調(diào)控抗菌肽的表達(dá)，增加免疫球蛋白A(IgA)和黏蛋白的分泌以及促進(jìn)抗炎癥免疫反應(yīng)，在腸道中發(fā)揮重要的免疫功能。EcN也能通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白閉鎖小帶的表達(dá)以及促進(jìn)緊密連接蛋白上調(diào)和再分布 ，對(duì)增強(qiáng)豬腸上皮細(xì)胞的緊密連接和提高黏膜屏障具有重要的作用。口服EcN能顯著降低斷奶仔腹豬瀉率和競(jìng)爭(zhēng)性阻礙沙門(mén)氏菌入侵，也能有效預(yù)防產(chǎn)毒素大腸桿菌的感染。由此可見(jiàn)，EcN對(duì)提高動(dòng)物腸道免疫功能、保護(hù)腸道屏障具有重要的作用。益生菌在腸道內(nèi)存活并黏附于腸道上皮細(xì)胞表面，是其發(fā)揮益生作用的前提和基礎(chǔ)。因此，本試驗(yàn)旨在探明EcN的生長(zhǎng)特性，耐酸、耐膽鹽和耐熱的性能，對(duì)豬腸上皮細(xì)胞黏附性能，以及對(duì)致病菌的抑菌效果，為EcN在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考意義。

1材料與方法

1.1 EcN生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和菌液制備

EcN菌株購(gòu)自德國(guó)微生物菌種中心(編號(hào)為DSM 6601)。大腸桿菌K88菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察。采用比濁法繪制EcN和大腸桿菌K88生長(zhǎng)曲線，以培養(yǎng)時(shí)問(wèn)(0~30 h)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的通過(guò)測(cè)定LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的600 nm吸光度值(OD600nm)，OD600nm為縱坐標(biāo)繪出EcN的生長(zhǎng)曲線。采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)EcN和大腸桿菌K88菌液，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)將菌液調(diào)整濃度約為1.0x108CFU/mL，用于體外抗逆性能、豬腸上皮細(xì)胞黏附性能和抑菌效果檢測(cè)。

1.2 IPEC-J2細(xì)胞的培養(yǎng)

豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞來(lái)自西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的凍存細(xì)胞。將復(fù)蘇細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，加入5 mL DMEM 完全細(xì)胞培養(yǎng)液(含5％胎牛血清+1％雙抗)，置于37℃ 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁率達(dá)85％時(shí)，胰酶消化，調(diào)整濃度約為2.0x105個(gè)/mL，置于六孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至單層后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 體外抗逆性能檢測(cè)

1.3.1 耐酸和耐膽鹽

取等體積EcN菌液分別置于pH 1.5、2.0和2.5的模擬胃液中，以pH 7.0模擬胃液為對(duì)照。再取等體積EcN菌液分別置于豬膽鹽濃度為0、0.30％ 、0.60％和0.90％的LB液體培養(yǎng)基中，每組3個(gè)重復(fù)。胃酸組和膽鹽組置于37℃ 200 r/min恒溫振蕩器中分別培養(yǎng)3和24 h。處理后與處理前細(xì)菌總數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)為EcN存活率。

1.3.2 耐熱

取4份9 mL滅菌生理鹽水于試管中并預(yù)熱至80℃ ，再分別加入1mL菌液，保溫30、40、50和60 S后，迅速冷卻，對(duì)不同保溫時(shí)間組菌液按10倍梯度進(jìn)行稀釋，吸取100 μL最佳稀釋濃度菌液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)，每組2個(gè)重復(fù)。調(diào)節(jié)水溫至70、65℃ ，重復(fù)上述試驗(yàn)，用1.3.1中的計(jì)算方法計(jì)算EcN存活率。

1.4 IPEC-J2細(xì)胞黏附和抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)組取2 mL DMEM 不完全細(xì)胞培養(yǎng)液(不含雙抗)和1 mL各時(shí)期(遲緩、對(duì)數(shù)、平穩(wěn)和衰亡期)EcN菌液加入IPEC-J2細(xì)胞，以等體積無(wú)菌PBS替代EcN菌液作為對(duì)照組，每組重復(fù)3孔，置于37℃ 5％ CO2培養(yǎng)2 h后，PBS漂洗5次，自然晾干，甲醇固定20 min，革蘭氏染色，油鏡下隨機(jī)選取25個(gè)視野，拍照和計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞上黏附的EcN菌數(shù)，細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)與加入細(xì)菌總數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)為EcN黏附率。

試驗(yàn)組取EcN菌液500 L與IPEC-J2細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)2 h后，再加入大腸桿菌K88菌液500 L和1 mL DMEM 不完全細(xì)胞培養(yǎng)液，以未加EcN的大腸桿菌K88菌液作為對(duì)照組。37℃ 5％ CO2繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，PBS漂洗5次，裂解細(xì)胞并10倍梯度稀釋裂解液，再均勻涂抹于選擇性培養(yǎng)基紫紅膽汁瓊脂(VRBA)上，平板計(jì)數(shù)。每組重復(fù)4孔，取平均值。按以下公式計(jì)算EcN對(duì)致病菌的黏附抑制率：黏附抑制率(％)=100x(對(duì)照組一試驗(yàn)組)/對(duì)照組。

取100μL大腸桿菌K88菌液均勻涂抹于瓊脂培養(yǎng)基上，于無(wú)菌超凈臺(tái)上室溫晾干，再用牛津杯(直徑為8 mm)進(jìn)行打孔。取200 μL EcN菌液置于瓊脂板上孔中，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，做3個(gè)重復(fù)，取平均值判定抑菌效果。

1.5 β-防御素-2和Toll樣受體水平的檢測(cè)

試驗(yàn)分為4組，試驗(yàn)組分別取l mL EcN(EcN組)、大腸桿菌K88(大腸桿菌K88組)及EcN+大腸桿菌K88混合液(體積比1：1，EcN+大腸桿菌K88組)置于IPEC-J2細(xì)胞已長(zhǎng)至單層的六孔培養(yǎng)板中，另以等體積PBS作為對(duì)照組，再加入2 mL DMEM不完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h后，PBS漂洗5次，胰酶消化后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管內(nèi)，4℃12 000 r/min離心5 min，棄上清，再漂洗、離心棄上清，然后加入1 mL蛋白質(zhì)裂解液，離心10 min取上清，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)β-防御素-2和Toll樣受體水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SAS 9.1.3軟件的GLM 程序進(jìn)行單因素方差分析，組間顯著性分析采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2結(jié)果與分析

2.1 EcN生長(zhǎng)曲線

EcN生長(zhǎng)曲線如圖l所示。接種4 h后呈快速上升趨勢(shì)，顯示其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)10 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，18 h后逐漸出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，24 h后此趨勢(shì)較明顯，逐漸進(jìn)入衰亡階段。

2.2 EcN體外抗逆性能

EcN耐酸試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。隨模擬胃液pH的降低，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。當(dāng)pH為2.5時(shí)，EcN存活率為30.26％，較對(duì)照組減少51.58％。pH為2.0和1.5時(shí)，EcN存活率分別為17.69％ 、10.44％ ，強(qiáng)酸性環(huán)境抑制EcN的生長(zhǎng)。

EcN耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)照組存活率為84.95％，隨膽鹽濃度增加，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。膽鹽濃度為0.30％時(shí)，其存活率迅速下降至27.34％ 。當(dāng)膽鹽濃度從0.30％增加至0.90％時(shí)，存活率下降趨勢(shì)較平緩。而膽鹽濃度在0.60％和0.90％時(shí)，EcN存活率分別為21.03％ 、15.21％。高膽鹽環(huán)境會(huì)抑制EcN的生長(zhǎng)。

EcN溫度耐受試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨水浴溫度升高和保持時(shí)間增加，EcN存活率逐漸降低。不同溫度保持30、40、50和60 S，在80℃ 時(shí)EcN存活率分別為15.86％、11.01％、5.29％和2.20％，除50和60 S差異不顯著(P>0.05)外，其余時(shí)間點(diǎn)差異顯著；在70℃ 時(shí)EcN存活率分別為59.03％、49.78％、43.61％ 和30.40％ ，各時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)；在65℃ 時(shí)EcN存活率分別為80.18％ 、73.57％ 、60.79％ 和49.34％ ，各時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)，存活率高于70和80℃。

2.3 EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附作用

以測(cè)定的EcN生長(zhǎng)曲線作參考，選用培養(yǎng)2、8、16和26 h的EcN，分別代表其遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)生長(zhǎng)階段，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附作用結(jié)果如圖3和表3所示。不同生長(zhǎng)階段的EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附率差異顯著(P<0.05)。以對(duì)數(shù)期EcN的黏附性能最佳，其每100個(gè)細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)為3 056個(gè)，黏附率達(dá)33.96％ ；其次是穩(wěn)定期，每100個(gè)細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)為2 043個(gè)，黏附率達(dá)22.70％；遲緩期和衰亡期的黏附性能分別居于第3和第4，每100個(gè)細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)分別為1174、661個(gè)，黏附率分別達(dá)13.04％ 、7.34％。

2.4 EcN對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用

EcN對(duì)大腸桿菌K88的黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。EcN對(duì)大腸桿菌K88的黏附抑制率達(dá)到87.84％。抑菌試驗(yàn)測(cè)得抑菌圈直徑為4.73 mm。結(jié)果表明，EcN對(duì)大腸桿菌K88具有良好的抑制效果。

2.5 EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響

EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞β-防御素-2和Toll佯受體4水平的影響如圖4所示 對(duì)照組β-防御素-2水平顯著低于EcN 組和EcN+人腸桿菌K88組(P<0.05)，而 大腸桿菌K88組差異不顯著(P>0.05)，對(duì)照組Toll樣受體4水平顯著低于其他3組(P<0.05)。EcN組的β-防御素-2和Toll樣受體4水平低于EcN+大腸桿菌K88組，但差異不顯著(P>0.05)。此外，大腸桿菌K88組β-防御素-2和Toll樣受體4水平略低于EcN組和EcN+大腸桿菌K88組，但差異均不顯著(P>0.05)。

3討 論

3.1 EcN的體外抗逆性能

研究表明，EcN擁有6種獨(dú)特的鐵攝取系統(tǒng)能產(chǎn)生鐵螯合劑[腸菌素(enterobactin)、沙門(mén)菌螯鐵蛋白(salmochelin)、耶爾森桿菌素(yersiniabactin)、產(chǎn)氣菌素(aerobactin)、枸櫞酸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ferric dicitrate transport system)和楚血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)(the chu heme transport locus)]，攝取環(huán)境中的鐵離子(Fe3+)，用于代謝時(shí)能量的產(chǎn)生。而中性偏酸性條件更有利于EcN鐵攝取系統(tǒng)產(chǎn)生4種鐵螯合劑(enterobactin、salmochelin、aerobactin和yersiniabactin) 。由此推測(cè)，中性偏酸性環(huán)境更適宜EcN生存。雖然本試驗(yàn)EcN存活率隨模擬胃液pH的降低而降低，但仍保持一定的存活，可見(jiàn)EcN對(duì)胃酸環(huán)境具有一定的耐受能力。豬胃內(nèi)pH一般在2.0～3.5，飼糧變化會(huì)使胃酸pH在1.5～5.0波動(dòng)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH 2.5的模擬胃液中EcN也能存活，提示其能通過(guò)胃酸環(huán)境，進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。EcN除需要耐受胃酸環(huán)境外，還應(yīng)耐受腸道中膽鹽形成的高滲透壓環(huán)境。豬腸道內(nèi)膽鹽含量一般在0.03％～0.50％內(nèi)波動(dòng)，而本試驗(yàn)顯示高膽鹽濃度(0.90％)環(huán)境下的EcN也依然能存活，可見(jiàn)EcN對(duì)腸道中的膽鹽環(huán)境也具有一定的耐受能力。此外，EcN在高溫環(huán)境中也能保持存活，表明其對(duì)溫度具有一定的耐受能力。關(guān)于益生菌耐酸、耐膽鹽、耐熱性能的具體機(jī)制，Hatice等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能產(chǎn)生胞外多糖，能耐受較低的pH和高膽鹽環(huán)境，Turpin等從分子水平發(fā)現(xiàn)益生菌乳酸片球菌(P.acidilactici)存在多種與耐酸、耐膽鹽、耐熱相關(guān)基因，如熱休克蛋白(groEL)基因、D-丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(dltD)基因、clpL(一種ATP酶)基因和膽汁酸水解酶(bsh)基因等。因此，關(guān)于益生菌EcN耐受強(qiáng)酸高膽鹽高溫環(huán)境是否也存在上述相關(guān)或者其他潛在機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 EcN的黏附性能和抑菌性能

本試驗(yàn)對(duì)比研究了4個(gè)時(shí)期的EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附能力的大小，其黏附效果以對(duì)數(shù)期最佳。熊濤等發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞黏附羅伊氏乳桿菌數(shù)隨菌齡增大呈先增后減的趨勢(shì)。這提示EcN能良好地黏附于IPEC-J2細(xì)胞表面可能與其生長(zhǎng)階段存在關(guān)聯(lián)。菌毛是細(xì)菌附著于動(dòng)物消化道黏膜上皮細(xì)胞表面的重要結(jié)構(gòu)，EcN 自身基因組編碼的FlA、FlC和卷曲菌毛能幫助其定植于IPEC-J2細(xì)胞上，并形成生物被膜抵御致病菌入侵。若缺乏FlC菌毛和鞭毛的表達(dá)，則會(huì)降低黏附性能和削弱對(duì)沙門(mén)氏菌入侵的抑制作用。也有文獻(xiàn)報(bào)道，EcN通過(guò)FlC菌毛調(diào)控對(duì)細(xì)胞的黏附作用以及對(duì)致病菌的抑菌作用。EcN誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞分泌β-防御素-2和促進(jìn)T細(xì)胞中Toll樣受體4的表達(dá)，對(duì)抑制病原菌入侵和減輕腸道炎癥具有重要作用，同時(shí)EcN誘導(dǎo)β-防御素-2的分泌可能與鞭毛存在關(guān)聯(lián)；若EcN缺失編碼Flc菌毛和鞭毛基因，黏附率分別降低99.9％和50.0％，同時(shí)降低抑菌能力。此外，EcN在IPEC-J2細(xì)胞上黏附和生長(zhǎng)期間會(huì)形成鞭毛，其鞭毛長(zhǎng)度和數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加 。由此可見(jiàn)，EcN良好地黏附于細(xì)胞表面發(fā)揮益生作用，F(xiàn)lc菌毛和鞭毛起著重要的作用。本試驗(yàn)關(guān)于EcN誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)β-防御素-2和Toll樣受體4的表達(dá)以及黏附作用機(jī)理只作了初步探究，而更深層次的黏附性能和抗菌機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中，用大腸桿菌K88感染預(yù)先與EcN培養(yǎng)一段時(shí)間的IPEC-J2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EcN對(duì)大腸桿菌K88黏附抑制率達(dá)87.84％。Boudeau等 副先將IPEC-J2細(xì)胞與EcN預(yù)先培養(yǎng)一段時(shí)間后再加入致病性大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和直接將2種菌同時(shí)加入IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)比研究EcN對(duì)致病性大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的抑制率為97.2％ ～99.9％ ，后者為7.0％ ～99.9％。Klete等 和Malchow等 也報(bào)道了預(yù)先將EcN與IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)，能降低致病性大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的感染機(jī)率，并影響致病菌對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲能力，而將EcN與沙門(mén)氏菌同時(shí)加入時(shí)，僅減少沙門(mén)氏菌入侵率為70％。推測(cè)EcN對(duì)細(xì)胞的黏附作用以及其生理功能的發(fā)揮可能存在時(shí)間效應(yīng)。研究表明，增加EcN與細(xì)胞的預(yù)先培養(yǎng)時(shí)間有利于抑制病原菌的入侵，同時(shí)提高EcN的劑量，抑制效果更好。EcN預(yù)先培養(yǎng)和較高劑量使用也有利于提高腸道黏蛋白mRNA的表達(dá)水平。綜上研究，EcN制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中盡早并高劑量使用，可能會(huì)更好的發(fā)揮益生作用。

本試驗(yàn)只對(duì)EcN相關(guān)機(jī)理只作了初步的探索，關(guān)于EcN黏附機(jī)理和對(duì)致病菌黏附抑制作用以及抗逆性能的研究，還需要從分子水平進(jìn)行更深入的探索。

4結(jié) 論

① EcN對(duì)豬腸上皮細(xì)胞黏附效果以對(duì)數(shù)期最佳，并對(duì)致病菌大腸桿菌K88存在較強(qiáng)的抑制作用。

② EcN面對(duì)高酸、高膽鹽環(huán)境也呈現(xiàn)一定的抗逆性能，有利于其在胃腸道內(nèi)發(fā)揮生理作用。